腹針對慢性阻塞性肺疾病呼吸肌疲勞模型大鼠作用研究*

關煒　郭娜　尚芳（山西省中醫藥研究院，山西　太原　030012）

?

腹針對慢性阻塞性肺疾病呼吸肌疲勞模型大鼠作用研究*

關煒郭娜尚芳
（山西省中醫藥研究院，山西太原030012）

【摘要】目的通過腹針治療慢性阻塞性肺疾病（COPD）呼吸肌疲勞的動物實驗研究，明確腹針治療COPD呼吸肌疲勞的治療作用，為進一步推廣該診療技術提供動物實驗證據。方法SD大鼠30只隨機數字表隨機分為對照組、模型組、腹針組3組，每組10只。煙熏聯合氣道內注射脂多糖法建立COPD大鼠模型。連續治療30 d后測定COPD大鼠血清和膈肌組織中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、線粒體中還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NOX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、細胞色素氧化酶（CCO）的活性。觀察對照組、模型組、腹針組大鼠肺組織病理形態學的改變。結果模型組大鼠精神不振，活動及食量明顯減少、瞇眼、扎堆、反應遲鈍、食少、體質量減輕、皮毛稀疏、灰黃無光澤有嚴重脫落、咳喘、呼吸道分泌物增加；正常組大鼠飲食正常、精神好，毛發光澤，反應靈敏，體質量正常。模型組大鼠體質量低于對照組（P＜0.05），針刺組大鼠體質量均高于模型組（P＜0.05）。模型組TNF-α含量高于空白對照組（均P＜0.05），腹針組TNF-α含量均低于模型組（均P＜0.05）。與對照組比較，模型組大鼠膈肌NOX、SDH、CCO組織線粒體中活性降低（均P＜0.05）；與模型組比較，腹針組NOX、SDH、CCO活性均升高（均P＜0.05）。大鼠肺組織病理形態學觀察，模型組支氣管黏膜上皮變性、壞死、脫落，支氣管壁出現炎性充血、水腫，有大量的炎性細胞浸潤，支氣管內有大量粘液性炎性滲出物。腹針組炎性充血、水腫，炎性細胞浸潤顯著減輕。結論腹針可能是通過減少TNF-α炎性介質釋放，提升COPD模型大鼠膈肌線粒體NOX、SDH、CCO活性，從而減輕COPD病理表現，進一步實現改善COPD呼吸肌疲勞、延緩COPD的進程的功能。

【關鍵詞】慢性阻塞性肺疾病呼吸肌疲勞腹針

慢性阻塞性肺疾病（COPD）嚴重影響患者的勞動能力和生活質量。預計中國在未來的半個世紀將會每年有150萬人死于COPD，到2020年COPD將成為全球第5位影響生存時間和生活質量的疾病［1］。呼吸肌疲勞在COPD的發展過程中十分常見，呼吸泵功能衰竭是患者呼吸衰竭的重要原因，也是COPD患者反復入院及致殘、致死的重要因素。研究發現反復性氣道炎癥是造成COPD患者氣道重構及進行性氣道阻塞的主要原因［2］，其強調了本病的炎癥特征，而TNF-α作為重要炎性介質，越來越受到重視。腹針療法通過刺激患者腹部穴位治療全身急慢性疾病及疑難疾病的針灸療法，具有“安全、無痛、高效、快捷”等優點［3］。孫晶等［3］研究指出針刺治療可抑制炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，降低組織或血清中其蛋白的含量，從而減少炎性介質的分泌，緩解COPD發病進程。本實驗應用腹針療法觀察對COPD呼吸肌疲勞模型大鼠的影響，通過ELISA法檢測大鼠血清TNF-α含量，膈肌組織線粒體混懸液中還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶（NOX）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、細胞色素氧化酶（CCO）活性，為進一步明確該療法在COPD呼吸肌疲勞中的治療作用提供證據。現報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠30只，雄性，體質量180～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號:SCXK（京）2014-0004。飼養環境平均溫度24℃，平均濕度36%，10～15次/h全新風，光照12 h明12 h暗，自由飲水進食。

1.2試劑大鼠TNF-αELISA試劑盒，購自武漢博士德生物科技有限公司；大鼠NOX、SDH、CCO ELISA試劑盒購自上海一研生物科技有限公司。大腸桿菌脂多糖:Sigma公司（NO.L8880）。

1.3儀器AT-858型自動酶標分析儀（上海）；F325旋轉石蠟切片機（英國）；TKY-BMB組織包埋機（湖北）；Excelsior全自動組織脫水機（英國Shandon）；Olympus顯微鏡（日本）等。

1.4分組與造模大鼠適應性飼養1周后，按隨機數字表法隨機分對照組、模型組、腹針組，每組10只。模型組和針刺組采用煙熏合并脂多糖氣管內注射復制COPD呼吸肌疲勞大鼠模型［5］。對照組不煙熏，氣管內注射等體積生理鹽水。

1.5針刺方法腹針組每日基礎治療（如吸氧）＋針刺中脘、下脘、氣海、關元，滑肉門（雙側），氣穴（雙側）。模型組和對照組給予基礎干預（如吸氧），共30 d，每周檢測1次各組大鼠體質量。

1.6標本采集與檢測末次針刺后，各組大鼠禁食6 h，大鼠固定于鼠臺，腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg將大鼠麻醉，心臟取血，取5 mL置于離心管中，靜置1 h后用一細長的針頭沿試管壁剝離血塊，然后3000 r/min離心10 min，取上清液，制備血清，-20℃保存。取右側膈肌，加分離介質，制備組織勻漿，梯度離心提取組織線粒體，制成線粒體懸液［6］。血清和膈肌組織勻漿中TNF-α含量的檢測采用ELISA法；ELISA法檢測線粒體懸液中NOX、SDH、CCO的活性，均按照試劑盒說明書進行操作。分離肺組織，4%多聚甲醛固定，進行病理學觀察。觀察大鼠肺組織顏色、體積、彈性、滲出情況；右肺下葉常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織病理形態變化。病理學觀察由筆者所在醫院病理科完成。

1.7統計學處理采用SPSS16.0統計學軟件。計量資料以表示，如符合正態分布、方差齊，則采用t檢驗，不符合正態分布，則采用秩和檢驗。計數資料以頻數（構成比）描述，采用X2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般情況觀察模型組大鼠精神不振，活動及食量明顯減少、瞇眼、扎堆、反應遲鈍、食少、體質量減輕、皮毛稀疏、灰黃無光澤有嚴重脫落、咳喘、呼吸道分泌物增加；正常組大鼠飲食正常、精神好，毛發光澤，反應靈敏，體質量正常。腹針組大鼠精神轉好，飲食增加，毛發明顯恢復光澤，反應明顯較前靈敏，體質量恢復正常。

2.2各組大鼠體質量比較見表1。結果示，模型組大鼠體質量低于對照組（P＜0.05），腹針組大鼠體質量均高于模型組（P＜0.05）。

表1　各組大鼠不同時間體質量比較

表1　各組大鼠不同時間體質量比較

與模型組比較，*P＜0.05；與對照組比較，△P＜0.05。下同。

組別　n腹針組　10對照組　10模型組　10 1周　2周　3周　4周334.43±15.89 350.80±17.71*372.09±19.56*400.45±23.91*393.74±20.21 421.80±22.25　435.56±25.34 457.14±33.52 329.01±16.74△337.91±10.12△358.67±15.22△370.57±19.40△

2.3各組大鼠血清和膈肌組織中TNF-α含量比較見表2。結果示，模型組TNF-α含量高于對照組（均P＜0.05），腹針組TNF-α含量均低于模型組（均P＜0.05）。

表2　各組大鼠血清和膈肌組織中TNF-α含量比較（pg/mL，

表2　各組大鼠血清和膈肌組織中TNF-α含量比較（pg/mL，

組　別　n　血清TNF-α　膈肌組織中TNF-α對照組　10　107.61±25.44　39.43±6.12模型組　10　243.41±45.12△　58.29±8.26△腹針組　10　184.90±45.74*　46.64±8.31*

2.4各組大鼠線粒體懸液中NOX、SDH、CCO活性比較見表3。與對照組比較，模型組大鼠膈肌NOX、SDH、CCO組織線粒體中活性降低（均P＜0.05）；與模型組比較，腹針組NOX、SDH、CCO活性均升高（均P＜0.05）。

表3　各組大鼠線粒體懸液中NOX、SDH、CCO活性比較（U/L，

表3　各組大鼠線粒體懸液中NOX、SDH、CCO活性比較（U/L，

組別　n　NOX對照組　10　31.64±5.89模型組　10　17.41±3.29△腹針組　10　23.64±4.62*SDH　CCO 25.80±6.09　9.90±3.43 15.89±5.53△　7.81±2.94 20.26±6.38*　8.53±3.26*

2.5各組大鼠肺組織病理形態學觀察比較見圖1。模型組:支氣管黏膜上皮變性、壞死、脫落，支氣管壁出現炎性充血、水腫，有大量的炎性細胞浸潤，支氣管內有大量黏液性炎性滲出物。腹針組:炎性充血、水腫，炎性細胞浸潤顯著減輕。

3　討論

本研究擬通過腹針治療COPD急性加重期呼吸肌疲勞的動物實驗研究，明確腹針對COPD呼吸肌疲勞的治療作用。由于人類COPD的主要原因是吸煙和慢性反復感染［7］，因此本實驗動物模型采用煙熏合并脂多糖氣管內注射復制COPD呼吸肌疲勞大鼠模型。該模型與人類COPD的發生情況相似從而更接近人類的COPD病理變化與形成過程。煙霧中的多種成分直接或間接導致氣道炎癥、肺組織破壞、氣道阻塞、免疫功能受抑以及促進致病微生物在下呼吸道定植等［8］。脂多糖是革蘭陰性菌的細胞壁成分，作為內毒素在病菌對機體的致病性方面起著重要作用。它可刺激單核巨噬細胞、上皮細胞及中性粒細胞等合成釋放一系列前炎癥因子和炎癥因子如TNF-α，介導氣道和肺組織的炎癥反應［9］。COPD患者無論在輕中重度，均有不同程度的膈肌功能下降，由于膈肌在呼吸過程中所起的作用占全部呼吸做功的80%，所以呼吸肌疲勞主要是膈肌疲勞。因此COPD大鼠模型同樣適用于COPD呼吸機疲勞大鼠模型。

圖1　各組大鼠肺組織病理形態學觀察比較（HE染色，20倍）

中醫學并沒有與COPD相對應的病名，根據其臨床表現，可將其歸為“肺脹”“喘證”等范疇。有研究［10］對近20年有關COPD的現代文獻統計分析后，結果表明COPD的病位在肺、脾、腎3臟。標實為痰濁、水飲、瘀血和氣滯，痰有寒化與熱化之分；本虛為肺、脾、腎氣虛，晚期則氣虛及陽，或陰陽兩虛。其基本病機是肺之體用俱損，呼吸機能錯亂，氣壅于胸，滯留于肺，痰瘀阻結肺管氣道，導致肺體脹滿，張縮無力，而成肺脹究其本質與肺脾關系最為密切。“肺主氣，司呼吸”，具有調節全身氣機，推動血液運行的作用，肺氣宣降不利，升降失常，則產生咳喘之癥，久則肺氣虛損。“肺朝百脈，主治節”，是血液進行氣體交換的場所，肺虛治節失職，則循環不利，血行澀滯，肺氣郁滯更甚，造成氣滯血瘀。脾胃屬土，脾為后天之本，萬物皆生化于脾土，久患肺病及母，脾氣亦虧，脾虛則水濕不化，聚而為痰，痰濕阻肺，郁而化熱，肺氣壅遏不暢，咳喘遂生，此即“脾為生痰之源，肺為貯痰之器”。脾氣虛也是呼吸肌疲勞發生的一個重要病理因素，由于“脾主肌肉”人體肌肉功能與脾胃的運化相關，脾胃為后天之本，化生氣血，供養肌肉。脾氣盛則運化水谷和轉輸精微功能正常，肌肉可以很好得以濡養。脾氣虛弱，吸收運化水谷的功能降低，氣血精微物質生成不足，則導致肌肉失養，終致肌肉瘦削、軟弱無力，甚至萎弱不用。由此可見，脾肺氣虛，呼吸肌失養，則容易出現呼吸肌疲勞，而表現為喘促、氣急，遇勞加劇等癥。腹針療法是薄智云教授經過20多年的研究創建的一種通過針刺腹部穴位調節先天、后天經絡，治療慢性病、疑難病的新療法［11］。此療法以神闕系統為核心，對全身系統進行宏觀調控。其選穴分為主穴、輔穴、佐穴、使穴四部（即君、臣、佐、使）。主穴是根據病情的需要，針對病因和主要癥狀進行臟腑辨證，以集中解決疾病的主要矛盾；輔穴是加強主穴調理臟腑的功效或兼顧調理其他相關臟腑癥狀的穴位；佐穴協助主穴和輔穴調整內臟后，進行經絡辨證，調理相關經脈或相表里經脈，治療一些次要癥狀；使穴為治療相關癥狀的穴位，具有引導氣血直達病所的作用，是治療疾病臨床癥狀的相應部位局部取穴，也有調和諸穴的作用［12］。任何的穴位都是一個已知的定位點而決不是任意點［13］。本實驗選取中脘穴、下脘穴作為主穴健脾和胃、降逆止嘔；氣海穴、關元穴配合培補元氣，為輔穴；滑肉門穴為足陽明脈氣所發，具有調中氣、和腸胃、理氣滯的作用，此穴為“腹四關”之二，與以上穴位合用有通腑之妙，促進血液循環，為佐穴［14］；氣穴位于臍中下3寸，旁開0.5寸，是人體足少陰腎經上的重要穴道，主要功能為補益沖任，為使穴。諸穴配合疏通經脈，可以使脾、腎的功能得到調整，恢復人體內臟的穩態。

膈肌張力、耐力的降低是發生膈肌疲勞、呼吸困難的機制，這兩個因素也是COPD呼吸肌疲勞的主要危險因素。COPD患者常有不同程度的膈肌功能障礙，尤其急性加重期時膈肌疲勞顯著，后者是導致呼吸衰竭的一個重要因素［15-16］。TNF-α是一種能誘導腫瘤組織出血壞死的物質，具有非常復雜的生物學活性，在免疫和非免疫系統中發揮著廣泛的作用，除了抗腫瘤作用外，還參與炎癥、發熱以及機體脂肪、蛋白質的分解代謝等病理生理過程［17］。研究已證實其在COPD患者血液、痰液、支氣管肺泡灌洗液及肺組織中是升高的，且與COPD患者的靜息能量消耗增加，惡液質形成和預后不良有關［18］。而重癥肌無力患者早期TNF-α可顯著升高，并存在細胞免疫功能紊亂［19］。線粒體是細胞呼吸和產生ATP的部位［20］。線粒體的內膜含有呼吸鏈和氧化磷酸化系統的全部酶包括SDH、CCO等。SDH是三羧酸循環的一個關鍵酶，其活性的高低及含量的多少影響著三羧酸循環的速度，三羧酸循環是機體長時間運動時產生能量的最重要的途徑。CCO是呼吸鏈中的關鍵酶，其活性的高低及含量的多少直接影響著呼吸鏈傳遞電子的效率［21］。NADH氧化酶通常簡寫為NOX，位于細胞外膜，在糖酵解、三羧酸循環和線粒體呼吸鏈中的氧化還原反應都離不開它的參與，主要為能量的存儲和釋放提供必要的準備。以上3項指標都可直接反應膈肌功能。本實驗結果表明模型組TNF-α含量高于對照組，腹針組TNF-α含量低于模型組，模型組NOX、SDH、CCO的活性均低于對照組，腹針組NOX、SDH、CCO的活性均高于模型組；病理結果顯示腹針組可減輕慢性支氣管炎模型大鼠支氣管黏膜層和黏膜下層炎性細胞的浸潤、減輕黏膜上皮細胞的壞死和脫落，減少氣道分泌物。結果示，腹針治療可以減少炎癥介質釋放，減輕炎癥反應，使NOX、SDH、CCO含量升高，提高呼吸鏈功能酶活性，有利于膈肌呼吸功能恢復，表明腹針可以改善COPD引起的膈肌疲勞，減緩COPD進程。

參考文獻

［1］謝俊剛，徐永健.國內外COPD流行病學進展［J］.中國實用內科雜志，2006，26（18）:1401.

［2］田春燕張繼紅.細胞因子與COPD炎癥機制研究進展［J］.臨床肺科雜志，2011，16（2）: 248-249.

［3］薄智云.腹針療法［M］.北京:中國科學技術出版社，1999: 8，101，172.

［4］孫晶.針灸治療腦缺血再灌注損傷炎癥反應的進展研究［C］.2012年浙江省針灸學會年會暨學術交流會論文匯編.

［5］顧延會，歐陽瑤.煙熏聯合脂多糖制備大鼠慢性阻塞性肺疾病動物模型［J］.重慶醫學，2012，41（13）:1295.

［6］柳君澤，高文祥，蔡明春，等.ATP濃度和缺氧暴露對大鼠腦線粒體RNA和蛋白質體外合成的影響［J］.生理學報，2002，54（6）:485-489.

［7］劉進.用氣道內滴入脂多糖和被動吸煙建立慢性阻塞性肺病大鼠模型［J］.浙江醫學，2004，26（4）:268.

［8］Kealings VM，Collins PD，Scott DM，et al.Difference in interlrukin-8 and tumer necrosis factor-α in induced sputum from patients with chronic obstructive pulmonary disease or asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，1996，153:530-534.

［9］Mikaml M，Llewellyn-Jones CG，Bayley D，et al.The chemotactic activity of sputum from patients with bronchiectasis［J］.Am J Respir Crit Care Med，1998，157（3）:723-815.

［10］張聰穎.慢性阻塞性肺疾病的研究進展［J］.中國中醫藥現代遠程教育，2015，212（12）:155-156.

［11］薄智云.談談腹針療法［J］.中國針灸，2001，21（8）:475.

［12］薄智云.腹針療法的處方特點［J］.中國針灸，2003，23（5）: 273-274.

［13］薄智云.談談腹針療法［J］.中國針灸，2001，21（8）:475.

［14］周素貞.腹針加TDP照射治療哮喘臨床觀察［J］.中醫中藥，2009，47（20）:98.

［15］Anania A，Striglia E.Muscle fatigue and dyspnea［J］.Minerva Med，1998，89（10）:365-369.

［16］McGuire M，Cantillon D，Bradford A.Effects of almitrine on diaphragm contractile properties in young and old rats［J］.Respiration，2002，69（1）:75-80.

［17］Nieto -Vazquez I，Fernández -Veledo S，deAlvaro C，et al.Protein -tyrosine phosphatase 1B -deficient myocytes showincreased insulinsensitivity and protection against tumor necrosis factor-alpha-induced insulin resistance［J］.Diabetes，2007，56（2）:404.

［18］王麗慧，曹作炎.IL-13和TNF-ɑ在慢性阻塞性肺疾病的表達及意義［J］.武漢大學學報:醫學版，2003，24（2）:113-116.

［19］張栩，孫兆林，叢志強，等.重癥肌無力病人外周血單個核細胞TGF-β及IL-6水平的測定［J］.青島大學醫學院學報，2003，39（4）:386-391.

［20］徐升，孫麗萍，張念志.培土生金法對COPD大鼠肺組織線粒體功能影響的實驗研究［J］.遼寧中醫雜志，2013，40 （6）:1239-1240.

［21］王茂葉.間歇性低氧訓練對小鼠機體細胞色素氧化酶和琥珀酸脫氫酶的影響［J］.天津體育學院學報，2005，20（6）: 26-28.

·證治探討·

·薪火傳承·

Effect of Abdominal Acupuncture on the Respiratory Muscle Fatigue Model with Chronic Obstructive Pulmonary Disease

GUAN Wei，GUO Na，SHANG Fang.Shanxi Institute of Chinese Medicine，Shanxi，Taiyuan 030012，China.

【Abstract】Objective: To study the animal experiments abdominal acupuncture on the respiratory muscle fatigue model of chronic obstructive pulmonary diseases（COPD），clarify its clinical effects，and provide evidence for the further promotion of the treatment technology.Methods: 30 SD rats，weighing 180 g to 220 g were adaptively fed for one week，and then，according to a random number table，were randomly divided into three groups，namely the control group，the model group，abdominal acupuncture group（n = 10）.Smoked joint intratracheal injection of lipopolysaccharide was used to make rat model COPD.After continuous treatment for 30 days，serum and tissues of diaphragm in COPD rat tumor necrosis factor-α（TNF-α），mitochondria reduced nicotinamide adenine dinucleotide nucleotide oxidase（NOX），succinate dehydrogenase（SDH），cytochrome oxidase（CCO）activity were detected.Pathological changes of lung tissues in rats of the three group were observed.Results: 1）The serum and the contents of TNF-α in diaphragm in rats in other two groups were higher than those in the control group（P＜0.05）and TNF-α content in abdominal acupuncture group increased significantly lower than that of the model group（P＜0.05）.2）The activity of NOX，SDH，CCO in diaphragm mitochondria in the model group and abdominal acupuncture group was significantly lower than that of the control group（P＜0.05）；the activity of NOX，SDH，CCO in diaphragm mitochondria in abdominal acupuncture group reduced less than that of the model group（P＜0.05）；3）Lung pathology showed: the model group: bronchial epithelial degeneration，necrosis，inflammation of the bronchial wall occurs congestion，edema，a large number of inflammatory cell infiltration，There were a lot of mu-cus bronchial inflammatory exudate；abdominal acupuncture group: significant reduce of bronchial mucosa and submucosa infiltration of inflammatory cells，mucosal epithelial cells necrosis and shedding，and airway secretions.Conclusion: There exists serum and TNF-α in diaphragm tissues increasing in COPD rat model with respiratory muscle fatigue.The activity of NOX，SDH，CCO in diaphragm mitochondria decrease.pathology appears bronchial epithelial degeneration，necrosis，inflammation of the bronchial wall occurs congestion，edema，a large number of inflammatory cell infiltration，and there is a lot of mucus performance inflammatory exudate within bronchial.After abdominal acupuncture intervention，the above situation can be significantly altered.The needle reduces the pathology of COPD probably by reducing TNF-α inflammation media release and upgrading activity of NOX，SDH，CCO in COPD diaphragm mitochondria，and thereby，COPD further realizing the improvement of respiratory muscle fatigue，delaying the process function of COPD，providing reliable Animal experimental evidence to abdominal acupuncture on COPD respiratory muscle fatigue.

【Key words】COPD；Respiratory muscle fatigue；Abdominal acupuncture

中圖分類號:R285.5

文獻標志碼:A

文章編號:1004-745X（2016）01-0068-05

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.023

*基金項目：山西省科技廳青年課題（2013021037-2）

收稿日期（2015-09-22）