抗心律失常藥物對(duì)2-APB誘發(fā)大鼠心房異位活動(dòng)的影響

解　巖，張婷婷

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)生理學(xué)教研室，黑龍江 大慶　163319)

抗心律失常藥物對(duì)2-APB誘發(fā)大鼠心房異位活動(dòng)的影響

解巖，張婷婷

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)生理學(xué)教研室，黑龍江 大慶163319)

摘要：目的研究抗心律失常藥物對(duì)2-APB誘發(fā)的大鼠心房異位活動(dòng)的抑制作用。方法通過連接多通道分析和獲取數(shù)據(jù)的等長張力傳感器測量2-APB誘發(fā)的異位活動(dòng)。結(jié)果2-APB劑量依賴性增加左心房的異位活動(dòng)，濃度分別為 1、5、10、20、50 μmol·L-1。抗心律失常藥物，奎尼丁(10 μmol·L-1)，利多卡因(10 μmol·L-1)，維拉帕米(5 μmol·L-1)抑制2-APB誘發(fā)的異位活動(dòng)。2-APB誘發(fā)的異位活動(dòng)能被無鈣液和Na+/Ca2+交換抑制劑所阻斷，如3′，4′-dichlorobenzamil hydrochloride (DHC)和Ni2+，而不能被非選擇性陽離子通道阻斷劑 Gd3+所阻斷。結(jié)論2-APB誘發(fā)的心房異位活動(dòng)能被經(jīng)典抗心律失常藥物所抑制，如奎尼丁，利多卡因，維拉帕米和鈉鈣交換抑制劑。2-APB可用于篩選那些能夠非選擇性抑制鈉通道，鈣通道和鈉鈣交換體的抗心律失常藥物。

關(guān)鍵詞：鈉鈣交換體抑制劑DHC;抗心律失常藥;利多卡因;奎尼丁;維拉帕米;大鼠,Wistar;2-APB

心血管疾病有著很高的致死率，其中心律失常占心血管疾病發(fā)病率的25%[1-2]。心肌細(xì)胞離子通道的結(jié)構(gòu)和功能的改變所引起的離子流變化是心律失常發(fā)生機(jī)制中研究的焦點(diǎn)[3]。心肌細(xì)胞膜上存在多種離子通道，如鈉通道、鉀通道、鈣通道等。這些通道表達(dá)和功能的彼此平衡是正常電生理的基礎(chǔ)，一旦這種平衡被打破，就會(huì)出現(xiàn)心律失常[4-5]。

心律失常嚴(yán)重危害人類健康，篩選新的抗心律失常藥物具有重要的意義。目前篩選抗心律失常候選藥物的方法包括：膜片鉗、電刺激模型、神經(jīng)刺激模型、缺血性心律失常模型和利用一些化學(xué)藥物誘發(fā)的心律失常模型如洋地黃、烏頭堿等[6]。采用不同的方法和模型聯(lián)合評(píng)價(jià)抗心律失常候選藥的作用是目前研究的關(guān)注點(diǎn)。

2-APB(2-AminoethoxydiphenylBorate)是一種細(xì)胞膜通透性分子，能作用于多種細(xì)胞，產(chǎn)生廣泛的作用。2-APB通常用于抑制IP3受體誘發(fā)的鈣釋放和抑制鈣庫操縱性鈣通道。然而最近有報(bào)道證明2-APB在某些情況下，能加強(qiáng)鈣離子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Wolkowicz等證實(shí)了2-APB能夠誘發(fā)離體大鼠左心房的異位活動(dòng)，If電流，氯通道，鈉鈣交換體等可能加強(qiáng)了2-APB的作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)的目的在于闡明2-APB誘發(fā)心律失常的機(jī)制，驗(yàn)證候選的抗心律失常藥物對(duì)2-APB的作用，為篩選抗心律失常藥物提供新的方法。

1材料和方法

1.1材料Wistar大鼠，雄性，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)醫(yī)動(dòng)字：0-9-2-1。2-APB、DHC、硫酸鎳、氯化釓和奎尼丁購自Sigma-Aldrich，利多卡因、維拉帕米購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)部，其余試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備首先將Krebs-Henseleit(KH)液置于HW-400恒溫平滑肌槽中加熱，設(shè)定溫度為37℃，打開超級(jí)恒溫器，設(shè)定溫度37℃，預(yù)熱20～30 min。再將小浴槽用KH液沖洗3遍以上確保清潔，確保無藥品殘留。并用37 ℃的KH液13 mL注入小浴槽中，用95%O2+5%CO2混合氣體進(jìn)行氧飽和。用雙蒸水(ddH2O)清洗實(shí)驗(yàn)中使用的器械。

1.2.2分離大鼠心房Wistar大鼠(200～240 g)用戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)麻醉，從劍突處打開胸腔，暴露心臟，用手輕輕抓住心臟，迅速剪開主動(dòng)脈，將心臟放在裝有37℃的KH液的平皿中 ，用小剪刀和彎鑷輕輕剪取心房，要注意保持心房的完整性，否則會(huì)影響心房的功能。

1.2.3懸掛心房用兩個(gè)膜片夾將心房兩端夾起固定在小浴槽中，分別掛在小浴槽下端的彎鉤和等長張力傳感器上，調(diào)節(jié)高度，使張力適中。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，小浴槽中的液體用95%O2+5%CO2混合氣體進(jìn)行氧飽和。

1.2.4輸入信號(hào)將BL-420生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)打開，選擇心房所對(duì)應(yīng)的通道，輸入張力信號(hào)，調(diào)節(jié)指標(biāo)為G=2000，T=0.1，F(xiàn)=30，開始記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1大鼠左心房和右心房的自發(fā)性機(jī)械活動(dòng)大鼠的右心房在實(shí)驗(yàn)條件下，能夠產(chǎn)生自發(fā)的機(jī)械活動(dòng)，頻率為每分鐘(253±32)次(n=6)，左心房并不產(chǎn)生自發(fā)的機(jī)械活動(dòng)(n=6)，如圖1。因此，為了排除右心房自發(fā)性機(jī)械活動(dòng)對(duì)實(shí)驗(yàn)中2-APB誘發(fā)的心房異位活動(dòng)的影響，在實(shí)驗(yàn)中我們使用的是大鼠左心房。

圖1　大鼠左右心房的自發(fā)性機(jī)械活動(dòng)(n=6)

2.2不同劑量的2-APB對(duì)大鼠左心房異位活動(dòng)的作用本實(shí)驗(yàn)記錄了1、5、10、20、50 μmol·L-1的2-APB對(duì)大鼠左心房異位活動(dòng)的作用。1、5 μmol·L-1的2-APB對(duì)大鼠左心房的作用比較微弱。20 μmol·L-1的2-APB能夠明顯誘發(fā)大鼠左心房的異位活動(dòng)，50 μmol·L-1的2-APB能夠誘發(fā)大鼠左心房急劇快速的收縮活動(dòng)，頻率為每分鐘(219±9)次(n=8)，比20 μmol·L-1的2-APB的作用強(qiáng)烈。但是20 μmol·L-1的2-APB能夠誘發(fā)大鼠左心房穩(wěn)定的異位活動(dòng)，而50 μmol·L-1的2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的機(jī)械活動(dòng)在觀察時(shí)間內(nèi)已經(jīng)逐漸耗竭。結(jié)果提示：20 μmol·L-1為最適濃度。在以下的實(shí)驗(yàn)中2-APB的使用濃度為20 μmol·L-1。見圖2。

注：ABC為不同劑量的2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動(dòng)的代表圖；D為2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動(dòng)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

圖22-APB劑量依賴性增加大鼠左心房的異位活動(dòng)

2.3鈉通道和鈣通道阻斷劑預(yù)處理對(duì)2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動(dòng)的作用本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用了兩類抗心律失常藥，鈉通道阻斷劑，利多卡因(10 μmol·L-1)和奎尼丁(10 μmol·L-1)，電壓依賴性L-型鈣通道阻斷劑維拉帕米(5 μmol·L-1)。用這三種藥物預(yù)先孵育大鼠左心房10 min之后，給予20 μmol·L-1的2-APB。結(jié)果(圖3)：這三種藥物都能明顯抑制2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動(dòng)的頻率，且實(shí)驗(yàn)中這三種藥物的使用濃度與臨床用藥濃度基本相同。結(jié)果提示:2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動(dòng)可能有鈉通道和電壓依賴性L-型鈣通道的參與。

注：和Ⅰ(僅2-APB 20 μmol·L-1)相比，aP<0.01。

圖3奎尼丁，利多卡因和維拉帕米預(yù)處理抑制2-APB誘發(fā)的異位活動(dòng)(n=10)

2.4鈉通道和鈣通道阻斷劑后處理對(duì)2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動(dòng)的作用2-APB作用于大鼠左心房5 min后，分別給予離子通道阻斷劑利多卡因(10 μmol·L-1)，奎尼丁(10 μmol·L-1)和維拉帕米(5 μmol·L-1)。觀察發(fā)現(xiàn)：2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動(dòng)頻率逐漸降低，高度也逐漸降低，最后直至完全消失，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示。結(jié)果再次提示：2-APB誘發(fā)的大鼠心房的異位活動(dòng)可能有鈉通道和電壓依賴性L-型鈣通道的參與。

注：和Ⅰ(僅2-APB 20 μmol·L-1)相比，aP<0.01。

圖4奎尼丁，利多卡因和維拉帕米預(yù)處理抑制2-APB誘發(fā)的異位活動(dòng)(n=10)

2.5鈉鈣交換抑制劑，非選擇性陽離子通道抑制劑和無鈣液對(duì)2-APB誘發(fā)的大鼠左心房異位活動(dòng)的作用鈉鈣交換體抑制劑 DHC(20 μmol·L-1) 和Ni2+(5 μmol·L-1)均能抑制2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動(dòng)，非選擇性陽離子通道劑Gd3+(100 μmol·L-1)不能抑制2-APB的作用，無鈣的Krebs-Henseleit灌流液幾乎能夠完全阻斷2-APB的作用(圖5)。結(jié)果提示，2-APB誘發(fā)大鼠心肌細(xì)胞的鈣超載是通過刺激內(nèi)鈣釋放和外鈣內(nèi)流實(shí)現(xiàn)的，而且外鈣的內(nèi)流是通過電壓依賴性L-型鈣通道，而不是通過非選擇性陽離子通道。2-APB作用的可能機(jī)制為：2-APB首先激活內(nèi)鈣的釋放，內(nèi)鈣的增加驅(qū)動(dòng)鈉鈣交換體，產(chǎn)生了凈的內(nèi)向電流，細(xì)胞膜去極化，鈉通道和電壓依賴性L-型鈣通道開放，內(nèi)流的鈣離子增加，產(chǎn)生了心房的異位活動(dòng)。

注：和Ⅰ(僅2-APB 20 μmol·L-1)相比，aP<0.01。

圖52-APB誘發(fā)的異位活動(dòng)能夠被 DHC，Ni2+和無鈣液所阻斷，不能被Gd3+阻斷(n=10)

3討論

我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)2-APB能劑量依賴性的誘發(fā)大鼠心房的異位活動(dòng)，并且該異位活動(dòng)能夠被鈉通道阻滯劑，鈣通道阻滯劑所阻斷。我們假設(shè)2-APB為我們提供了另外一種方法用于篩選非選擇性阻斷鈉通道，鈣通道的抗心律失常藥物。眾所周知，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的升高能夠激活鈉鈣交換體，產(chǎn)生了瞬時(shí)內(nèi)向的電流，細(xì)胞膜去極化，爆發(fā)動(dòng)作電位。由此，結(jié)合我們目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，2-APB誘發(fā)的心房異位活動(dòng)的簡略過程：2-APB引起細(xì)胞內(nèi)鈣的增加，鈉鈣交換體被激活，每將一個(gè)鈣離子轉(zhuǎn)移出細(xì)胞外就將三個(gè)鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，從而產(chǎn)生了凈的內(nèi)向電流，細(xì)胞膜去極化，電壓門控鈉通道被激活，鈉離子內(nèi)流，細(xì)胞膜進(jìn)一步去極化，電壓依賴性L-型鈣通道被激活，鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞中鈣離子的進(jìn)一步增加誘發(fā)了大鼠左心房的異位活動(dòng)。鈉/鈣交換，鈉通道和鈣通道是2-APB誘發(fā)心房異位活動(dòng)中的三個(gè)關(guān)鍵步驟，阻止其中的任何一個(gè)都將抑制2-APB誘發(fā)的心房異位活動(dòng)。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)鈉通道阻斷劑，鈣通道阻斷劑或鈉鈣交換抑制劑能夠完全抑制2-APB誘發(fā)的心房異位活動(dòng)，并且實(shí)驗(yàn)中這些抗心律失常藥物的使用濃度幾乎與臨床用藥的濃度相同。

2-APB在體外能夠明顯誘發(fā)大鼠左心房的異位活動(dòng)，但是體內(nèi)注射卻不能引起明顯的心律失常。當(dāng)致死劑量的2-APB被注射至大鼠體內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生竇性心動(dòng)過緩和竇性停搏(數(shù)據(jù)沒有顯示)。2-APB能夠作用于多種細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的作用，例如，抑制或激活鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]，抑制TRPC通道[10]，激活TRPV渠道[11]，抑制電壓門控的K+通道[12]。因?yàn)?-APB涉及不同的生理功能，因此我們不能簡單地從2-APB的體外數(shù)據(jù)去推斷出2-APB的體內(nèi)作用。

經(jīng)典的抗心律失常藥物奎尼丁、利多卡因、維拉帕米能抑制2-APB誘發(fā)的大鼠左心房的異位活動(dòng)。2-APB可用于篩選那些能非選擇性抑制鈉通道、鈣通道和鈉鈣交換體的抗心律失常藥物。

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Inhibition of 2-aminoethoxydiphenyl-borate-induced rat atrial ectopic activity by antiarrhythmic drugs

XIE Yan,ZHANG Ting-ting

(DepartmentofPhysiology,DaqingCampusofHarbinMedicalUniversity,Daqing，Heilongjiang163319,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the inhibition of 2-APB-induced rat atrial ectopic activity by antiarrhythmic drugs.Methods2-APB-induced ectopic activity was measured through an isometric force transducer connected to amultichannel acquisition and analysis system.Results2-APB dose-dependence increased the ectopic activity of left atria at 1,5,10,20,50 μmol·L-1.Anti-arrhythmic drugs,quinidine(10 μmol·L-1),lidocaine (10 μmol·L-1),verapamil (5 μmol·L-1) inhibited 2-APB-induced ectopic activity.2-APB-induced ectopic activity was inhibited by Ca2+-free bath,Na+/Ca2+exchanger blockers,3’,4’-dichlorobenzamil hydrochloride (DHC) and Ni2+,not by non-selective cation channel blocker Gd3+. Conclusions2-APB-induced atrial ectopic activity was inhibited by classic anti-arrhythmic drugs quinidine,lidocaine,verapamil,and Na+/Ca2+exchanger blockers.It can be used for testing agents able to affect any of Na+,Ca2+channel,Na+/Ca2+exchanger without selectivity.

Key words:Anti-Arrhythmia Agents;Lidocaine;Quinidine;Verapamil;Rats,Wistar;2-Aminoethoxydi pheny borate

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.05.005

(收稿日期：2016-01-11，修回日期：2016-03-11)