小鼠Klf4基因的原核表達研究

孟書燕，郭 杰，高庚渠，劉改霞，馬 威

(河南質量工程職業學院，河南平頂山 467000)

小鼠Klf4基因的原核表達研究

孟書燕，郭 杰，高庚渠，劉改霞，馬 威*

(河南質量工程職業學院，河南平頂山 467000)

摘要[目的]對小鼠Klf4基因重組蛋白進行原核表達分析。[方法]利用雙酶切從重組質粒pMXs-Klf4上回收小鼠Klf4基因片段，克隆入pET-41a(+)載體后轉化BL21大腸桿菌，用IPTG誘導表達，探討誘導表達最佳濃度和時間，最后采用SDS-PAGE對重組蛋白進行鑒定及分析。[結果]重組質粒Klf4-pET-41a(+)在IPTG誘導下可表達與預期相符的約為51 ku的KLF4蛋白；經IPTG刺激后重組蛋白表達增多，以0.8 mmol/L IPTG誘導6 h為佳；重組蛋白以包涵體形式存在于大腸桿菌BL21中。[結論]小鼠Klf4基因可在原核細胞中表達。

關鍵詞小鼠；Klf4基因；原核表達；大腸桿菌

Krüppel樣因子4(Krüppel-likefactor4，Klf4)為1996年發現的鋅指轉錄因子家族成員之一，其在細胞增殖、分化、胚胎發育等生命過程中發揮重要作用[1]。研究表明，采用體外導入Klf4、Oct4/POU5F1、Sox2和c-Myc 4個轉錄因子可將小鼠體細胞直接重構為胚胎干細胞(ES，embryonicstemcells)樣的誘導性多能干細胞[2]，因此Klf4作為分化體細胞重編程的重要誘導因子之一，一直是該領域的研究熱點[3]。但目前關于Klf4基因原核表達的研究較少。筆者以小鼠Klf4基因為目的基因，構建原核表達載體，對其原核表達進行分析，為今后Klf4融合蛋白多克隆抗體制備及其基因表達調控機理的功能研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1主要試劑、載體及菌株大腸桿菌工程菌DH5α、BL21(DE3)、pMXs重組質粒和原核表達載體pET-41a(+)均為西北農林科技大學干細胞研究中心保存；DNA純化回收試劑盒(Tiangen)，蛋白Marker、SalⅠ、NcoⅠ、PstⅠ和HindⅢ、T4DNA連接酶、DNAMarker、Amp、Kan(TaKaRa)，其他試劑均為國產分析純。

1.2小鼠Klf4基因原核表達載體的構建與鑒定用SalⅠ和NcoⅠ分別對含有小鼠Klf4基因片段的pMXS-Klf4重組質粒和pET-41a(+)進行37 ℃雙酶切，前者回收Klf4基因片段，后者回收大片段，并將兩者在16 ℃連接過夜。將連接產物轉化DH5α感受態細胞，先經SalⅠ和NcoⅠ雙酶切鑒定，再經PstⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確后，獲得重組原核表達載體Klf4-pET-41a(+)。

1.3重組質粒Klf4-pET-41a(+)的誘導表達將陽性重組質粒接種于含Kan的LB液體培養基中，37 ℃培養過夜，將菌液按1%劑量接種于50mL相同LB培養基中，200r/min振蕩培養至OD為0.6左右，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導表達，在誘導不同時間(4、6h)分別取樣1.5mL。同時以誘導的pET-41a(+)載體作為陰性對照。

1.4小鼠Klf4基因表達產物的SDS-PAGE分析將1.5mL誘導菌液4 ℃離心收集菌體，室溫12 000r/min離心1min，棄上清，加入100μL1×SDS凝膠加樣緩沖液重懸，100 ℃煮沸10min后冰浴10min，室溫12 000r/min離心1min，取上清進行12%SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R250染色觀察。

1.5重組質粒Klf4-pET-41a(+)誘導表達條件的優化①將含Klf4-pET-41a(+)的BL21以1%劑量接種于含Kan的LB培養液中，37 ℃培養3～4h，分別加入IPTG至終濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L進行誘導，SDS-PAGE電泳分析結果。②將含Klf4-pET-41a(+)的BL21以1%劑量接種于含Kan的LB培養液中，37 ℃培養3～4h，在添加0.8mmol/LIPTG后繼續誘導0、4、5、6、7h分別取樣處理，SDS-PAGE電泳分析。

1.6融合蛋白表達形式的鑒定收集100mL菌液，12 000r/min離心5min，棄去培養液，PBS洗滌2次，12 000r/min離心5min后棄去上清。5mLPBS懸浮沉淀，冰浴條件下對菌體進行超聲波破碎(工作條件為：400W，5s，5s，30min)，待菌體懸浮液由黏稠變透亮時即可。12 000r/min離心40min，取上清100μL，加入1×SDS上樣緩沖液混合完全，后加入PBS重懸沉淀，再加入1×SDS上樣緩沖液混合制樣，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

2結果與分析

2.1pMXs-Klf4重組質粒的酶切鑒定重組質粒pMXs-Klf4經雙酶切后獲得一條約為1 925bp的基因片段，根據載體的酶切位點分析，并與NCBI上公布的小鼠Klf4基因長度相比，可以確定該特異性條帶即為Klf4片段(圖1)。

注：M.DL2 000 DNA Marker；1.酶切結果(SalI和NcoI)。Note：M.DL2 000 DNA Marker；1.Product of plasmid digested by SalI and NcoI.圖1　pMXs-Klf4的雙酶切結果Fig.1　Identification of plasmid pMXs-Klf4 by double restriction endonuclease digestion

2.2Klf4-pET-41a(+)重組質粒的酶切鑒定提取陽性重組表達質粒Klf4-pET-41a(+)進行酶切鑒定。經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示經SalⅠ和NcoⅠ雙酶切獲得一條約1 925bp條帶，與預期片段大小相符；經PstⅠ和HindⅢ雙酶切獲得一條約1 460bp條帶，與預期片段大小相符。

2.3Klf4-pET-41a(+)重組質粒的誘導表達鑒定將含有Klf4-pET-41a(+)的BL21 37 ℃培養后，加入1mmol/LIPTG誘導表達，于不同時間取樣進行SDS-PAGE電泳，結果在約77ku處有明顯的蛋白條帶，與預期融合蛋白大小一致，而未誘導的重組菌對照組未見該條帶(圖2)。

注：1.未誘導的Klf4-pET-41a(+)；2.加入IPTG誘導4 h后的Klf4-pET-41a(+)；3.pET-41a(+)空載體誘導4 h；4.加入IPTG誘導6 h后的Klf4-pET-41a(+)；5.pET-41a(+)空載體誘導6 h；M.蛋白Marker。Note：1.Non-induced Klf4-pET-41a(+)；2.Klf4-pET-41a(+)after IPTG induction for 4 h；3.pET-41a(+)empty carrier induction for 4 h；4.Klf4-pET-41a(+)after IPTG induction for 6 h；5.pET-41a(+)empty carrier induction for 6 h；M.Protein Marker.圖2　表達產物的SDS-PAGEFig.2　SDS-PAGE analysis of expressed protein

2.4Klf4-pET-41a(+)重組質粒誘導表達條件的優化在誘導時間相同的條件下，通過改變誘導物IPTG濃度來觀察IPTG濃度對KLF4蛋白表達的影響。在IPTG濃度為0.8mmol/L時KLF4蛋白的表達量最多，因此，最適IPTG濃度為0.8mmol/L(圖3)。當加入終濃度為0.8mmol/L的IPTG后，觀察不同時間對KLF4蛋白表達的影響，結果表明誘導6h后KLF4蛋白的表達量較多，因此，最適誘導時間為6h(圖4)。

注：M.蛋白Marker，1～7分別為IPTG濃度為1.0、0.8、0.6、0.6、0.4、0.2、0 mmol/L。Note：M.Protein Marker；1-7.IPTG concentration 1.0,0.9,0.6,0.6,0.4,0.2,0 mmol/L,respectively.圖3　不同IPTG濃度對KLF4蛋白表達的影響Fig.3　Effects of different concentration of IPTG on the expression of KLF4 protein

注：M.蛋白Marker，1.誘導3 h，2.誘導4 h，3.誘導5 h，4.誘導6 h。Note：M.Protein Marker；1.Induction for 3 h；2.Induction for 4 h；3.Induction for 5 h；4.Induction for 6 h.圖4　不同時間對KLF4蛋白表達的影響Fig.4　Effects of different time on the expression of Klf4 protein

2.5目的蛋白表達形式的鑒定含重組質粒Klf4-pET-41a(+)的菌體誘導后超聲破碎，離心獲得上清和沉淀，SDS-PAGE電泳結果顯示，上清中幾乎無目的蛋白存在，而在沉淀中含有大量目的蛋白，說明誘導表達的KLF4蛋白是以包涵體的形式存在于細菌胞液中(圖5)。

注：1.未誘導含pET-41a(+)的BL21蛋白，2.誘導6 h含pET-41a的BL21蛋白，3.未誘導的含Klf4-pET-41a+的BL21蛋白，4.0.8 mmol/L IPTG誘導6 h的含Klf4- pET-41a+的BL21蛋白，5.破碎含重組載體的細胞后的上清，6.破碎含重組載體的細胞后的沉淀，M.蛋白Marker。Note：1.The protein in BL21 with non-induced pET-41a(+)；2.The protein in BL21 with IPTG induced pET-41a(+)；3.The protein in BL21 with non-induced Klf4 -pET-41a(+)；4.The protein in BL21 with 0.8 mmol/L IPTG induced Klf4 -pET-41a(+)for 6h；5.The supernatant of induced BL21 with Klf4-pET-41a(+)；6.The precipitation of induced BL21 with Klf4 -pET-41a(+)；M.Protein Marker.圖5　目的蛋白表達形式的鑒定Fig.5　The identification of the expressed KLF4 protein

3討論

KLF4蛋白結構的高度保守性決定了Klf4是一個雙向調節的轉錄因子，其參與維持干細胞的全能性、調控細胞增殖、促進正常組織的生長，并與腫瘤的形成與發展有關[4-6]。研究表明，Oct4/POU5F1、Sox2、Klf4和c-Myc可將小鼠成纖維細胞誘導為多能性干細胞(inducedpluripotentstemcells，iPSC)，說明這4因子在細胞重編程中發揮重要作用[2]。關于Klf4的研究主要集中于對4因子共同調控作用的分析，而對于單轉錄因子的作用研究較少[7]。該研究利用酶切技術構建Klf4 -PET-41a(+)重組質粒，經IPTG誘導表達與預期相符的約為51ku的KLF4蛋白，且經IPTG刺激后重組融合蛋白表達明顯上調，其中以IPTG為0.8mmol/L誘導6h效果最佳。

稀有密碼子的存在影響目的基因在大腸桿菌中的高效表達[8]，在大腸桿菌的8個稀有密碼子中，小鼠Klf4基因中有AGA、AGC、CCG、CCC4種，且均位于近氨基端，這是小鼠KLF4蛋白誘導表達時存在潛在低量表達的原因之一。解決該問題最好用點突變的方法將稀有密碼子進行改造，以提高表達效率[9]。

體外誘導表達小鼠KLF4蛋白，有助于研究KLF4蛋白對細胞重編程的作用，以及與其他多能性相關因子的相互作用，為進一步研究該基因的體外功能提供理論依據。

參考文獻

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TheResearchofProkaryoticExpressionofKrüppel-likeFactor4inMouse

MENGShu-yan,GUOJie,GAOGeng-qu,MAWei*etal

(HenanQualityPolytechnic,Pingdingshan,Henan467000)

Abstract[Objective] Prokaryotic expression analysis of recombinant protein of Klf4 gene in mice was conducted. [Method] Klf4 gene segments were recovered from recombinant plasmid pMXs-Klf4 by double enzyme digestion, then they were cloned into pET-41a (+) vector and transformed into E.coli BL21. The expression was induced by IPTG, the optimal concentration and time was explored, finally, SDS-PAGE was adopted to identify and analyze recombinant plasmid. [Result] Induced by IPTG, recombinant plasmid Klf4-pET-41a(+) can be expressed in accordance with the expected protein about 51 ku; after IPTG stimulation, the expression of recombinant protein was increased, and 0.8 mmol/L IPTG induction for 6 h was optimal; the recombinant protein was expressed in the form of inclusion bodies in E. coli BL21.[Conclusion] The mouse Klf4 gene can express in prokaryotic cells.

Key wordsMouse; Klf4 gene; Prokaryotic expression; E. coli

作者簡介孟書燕(1986- )，女，河南漯河人，助教，碩士，從事食品微生物研究。*通訊作者，副教授，從事食品化工研究。

收稿日期2016-04-06

中圖分類號Q 78

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-133-03