以脂肪酶活為指標快速篩選吉他霉素高產菌株的研究

劉守強， 趙 中， 王雪潔， 劉 果， 周淑梅

(1.天方藥業有限公司,河南駐馬店 463000;2.黃淮學院數學科學系,河南駐馬店 463000;3.河南省駐馬店市環境保護局,河南駐馬店 463000)

以脂肪酶活為指標快速篩選吉他霉素高產菌株的研究

劉守強1， 趙 中2， 王雪潔1， 劉 果1， 周淑梅3

(1.天方藥業有限公司,河南駐馬店 463000;2.黃淮學院數學科學系,河南駐馬店 463000;3.河南省駐馬店市環境保護局,河南駐馬店 463000)

摘要[目的]篩選吉他霉素高產菌株。[方法]以1株北里鏈霉菌Zn14-05為出發菌株,進行紫外線與NTG復合誘變處理，通過以脂肪酶活力為初篩指標和搖瓶復篩篩選吉他霉素高產菌株。[結果]搖瓶發酵效價比出發菌株提高10%；傳代試驗結果表明其遺傳性能穩定。[結論]以高脂肪酶活性為初篩指標選育吉他霉素高產突變株，縮短了選育周期，減少了初篩工作量，提高了選育效率。

關鍵詞紫外射線；突變株；吉他霉素；脂肪酶

吉他霉素是由鏈霉菌所產生的一種多組分的大環內酯類抗生素，抗菌性能與紅霉素相似，對革蘭陽性菌有較強的抗菌作用，較紅霉素稍弱，但對耐紅霉素等金黃色葡萄球菌有效，細菌對之耐藥性產生較慢，該品系非耐藥誘導藥物。隨著抗生素耐藥問題的不斷凸顯，吉他霉素以其低耐藥性的特性，豐富了現有抗生素品種，并且作為一種獸用飼料添加劑，市場需求較大。吉他霉素生產研究進展較緩慢，自1953年發現以來，期間不斷有研究報道篩選出優良高產菌株，1990年四川抗菌素工業研究所分離得到1株高產菌株，其效價較原菌株提高100倍，后期研究在提高菌株效價的同時，提高了吉他霉素有效組分的含量，實現了工業化生產，自1995年以來，生產技術一直沒有大的突破。

在抗生素發酵過程中，工業化生產菌大多數是通過誘變育種方法獲得，傳統的誘變育種不僅可以獲得穩定的高產菌株，更以技術要求不高和操作簡便而在生產中廣泛應用。 筆者通過對出發菌株紫外誘變結合氯化鋰、NTG復合處理，以高脂肪酶活力為初次篩選指標，進行了吉他霉素高產菌株選育，以期為吉他霉素工業化生產提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌。吉他霉素菌株Zn14-05由河南天方藥業股份有限公提供。

1.1.2培養基。平板培養基：淀粉15.00 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L，硫酸鎂0.60 g/L，酵母膏4.00 g/L，豆油40.00 g/L，瓊脂21.00 g/L,消前pH 7.2,羅丹明B，氯化鋰 8.00 g/L。種子搖瓶培養基：淀粉20.00 g/L，黃豆餅粉18.00 g/L，氯化鈉4.00 g/L,葡萄糖10.00 g/L,碳酸鈣3.00 g/L,消前pH 7.2。發酵搖瓶培養基：淀粉18.00 g/L，黃豆餅粉20.00 g/L，硫酸鋅0.06 g/L，磷酸二氫鉀0.50 g/L,豆油40.00 g/L,消前pH 7.2。

1.2方法

1.2.1培養方法。

1.2.1.1平板、斜面培養。(28.0±0.5)℃恒溫培養10 d，4 ℃冰箱保藏。

1.2.1.2種子培養。由茄子瓶斜面挖約1 cm2大小塊狀物，接入裝有50 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，(28.0±0.5)℃、240 r/min 搖床培養26～32 h。

1.2.1.3搖瓶發酵培養。 將種子液按10%的接種量接入裝有50 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，(28.0±0.5)℃、240 r/min 搖床培養110 h。

1.2.2誘變方法。以吉他霉素菌株Zn14-05為出發菌株，用鏟子刮下新鮮斜面孢子，放入裝有玻璃珠并加入無菌生理鹽水的三角瓶中，搖勻攪散，滅菌后單層擦鏡紙過濾,鏡檢單孢子分散度在95%以上用于誘變處理。在誘變前進行稀釋，然后按常規誘變方法進行誘變處理[1]。

1.2.3篩選方法。

1.2.3.1紫外線誘變篩選。吸取單孢子懸浮液6 mL于含磁力旋子的平板中, 置于30 W的UV 燈(253.7 nm)下25 cm處,通過磁力攪拌照射處理,照射時間控制殺死率在90%左右，然后加入到平板培養基中28 ℃避光培養120 h，挑取水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌株。

1.2.3.2NTG誘變處理。以紫外線誘變所得水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌株為出發菌株，將菌株斜面孢子涂布于培養基平板(不含氯化鋰和羅丹明B)上，蘸取少量NTG顆粒置于平板中央，28 ℃培養48 h后刮下抑菌圈周圍的菌苔，稀釋后涂布于培養基平板上，28 ℃再培養10 d，挑取水解圈直徑與菌落直徑比值大的菌株進行搖瓶初篩、復篩，獲得高產突變株。

1.2.4吉他霉素效價測定。采用管碟法[2]。參照《中國藥典》2010版附錄×IA依法測定，試驗用菌為枯草芽孢桿菌， 用微生物自動測量分析儀測量并計算結果。

2結果與分析

2.1菌株脂肪酶活力與產吉他霉素效價之間的關系吉他霉素產生菌菌體分泌的脂肪酶可將分離培養基中的豆油水解成甘油和脂肪酸，使羅丹明B呈粉色，產生水解圈。水解圈直徑與菌落直徑比值反映出脂肪酶活力的大小。選擇不同生產能力的菌株涂布在分離培養基上培養，統計水解圈直徑與菌落直徑比值與效價的關系。

表1水解圈直徑與菌落直徑比值與效價的關系

Table 1Relationship between the hydrolytic circle and the colony diameter ratio and titer

菌株Stain效價Titer∥U/mL比值Ratio178601.16296501.433108651.604112641.655121161.756134621.90

植物油可提高藤倉赤霉菌合成赤霉素的能力，植物油減輕了碳代謝抑制，并有利于乙酰輔酶A和前體物供給[3-4]。植物油作為抗生素發酵碳源利用時，減輕了葡萄糖代謝所產生的抑制作用，但生產菌株脂肪酶活性的高低是影響抗生素效價提高的關鍵[5]。由表1可知，吉他霉素產生菌落直徑與水解圈直徑比值的大小與效價有一定的關系，呈正相關。也就是說，水解圈的大小反映出該菌株的效價高低，通過水解圈的大小來判斷菌株的生產能力是可靠的。

2.2NTG誘變獲得高產突變株經NTG誘變，挑選出10株菌，搖瓶初篩后得到5株搖瓶效價比初始出發菌株高的菌。將效價提高8%以上的菌株進行分離純化，菌落的一部分接斜面，一部分接搖瓶考察效價。搖瓶復篩后獲得1株發酵效價比出發菌株高且遺傳穩定的菌株，其中最高的Zn14-12菌株的吉他霉素產量提高了10%。

2.3高產菌株遺傳穩定性考察 將篩選到的突變菌株Zn14-12用群體連續傳至第5代的方法考察其傳代穩定性,測定每代的效價。由圖1可知，菌株連續群體傳至第3代斜面效價與F1代持平，第4代效價是F0代的95%，第5代降低較多，只有F0的88%，表明菌株Zn14-12的高產遺傳特性是穩定的。

表1　傳代次數對發酵效價的影響 Fig. 1　Effects of passage number on fermentation titer

3結論與討論

該研究對吉他霉素產生菌株Zn14-05經紫外線和氯化鋰、NTG復合誘變處理，以高脂肪酶活性為初篩指標選育吉他霉素高產突變株，縮短了選育周期，減少了初篩工作量，提高了選育效率，突變株效價比出發菌株高出10%。經連續5次群體傳代和效價考察，F4發酵水平穩定在F0的95%以上。

在抗生素生物合成中,前體起著重要作用,一定條件下可控制菌體合成次級代謝產物的方向并增加其產量。吉他霉素內酯環是由5個乙酸單位、1個丙酸單位、1個丁酸單位、1個羥基乙酸單位通過與脂肪酸合成相似的聚酮體途徑縮合而成[6]，短鏈脂肪酸作為次級代謝生物合成的前體，而在含油培養基中發酵培養時，油是短鏈脂肪酸產物的主要來源。脂肪酶活力高的產生菌就可能為合成次級代謝物提供更多的短鏈脂肪酸作為生物合成的前體。脂肪酶的水解作用是吉他霉素產生菌吸收利用豆油的第1步。該研究表明，菌株脂肪酶的活力不同，其產生吉他霉素的能力也顯著不同，而且表現出明顯的正相關，利用該性質，可快速判斷菌株的發酵水平，指導菌種初篩，提高工作效率。

參考文獻

[1] 施巧琴，吳松剛.工業微生物育種學[M].北京：科學出版社，2003:125-183.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:二部[S].北京:中國醫藥科技出版社，2010:附錄,93-95.

[3] GANCHEVA V,DIMOVA T S,KAMENOVA K,et al．Biosynthesis of gibberellins．III．Ptimization of nutrient medium for biosynthesis of gibbereUins upon using mathematical methods for planningthe experiments[J]．Acta microbiol bulgafiea，1984，14：80-86.

[4] TUDZYNSKI B．Biosynthesis of gibberellins inGibberellafujikuroi：Biomoloeular aspects[J]．Appl Micmbb Bioteehnol，1999，52：298-310.

[5] 張嗣良，儲炬．多尺度微生物過程優化[M].北京：化學工業出版社，2003:293-295.

[6] 陳代杰．抗菌藥物與細菌耐藥性[M]．上海：華東理工大學出版社，2001:131.

Rapid Screening of Kitasamycin High-yield Strains with Lipase Activity as the Index

LIU Shou-qiang1, ZHAO Zhong2, WANG Xue-jie1et al

(1. Topfond Pharmaceutical Co., Ltd., Zhumadian, Henan 463000; 2. Department of Mathematics, Huanghuai University, Zhumadian, Henan 463000)

Abstract[Objective] To screen a kitasamycin high-yield strain. [Method] With streptomyces kitasatoensis Zn14-05 as an original strain, UV and NTG compound mutagenesis was adopted. Lipase activity was used as the early screening index, shake-flask screening was used to obtain the kitasamycin high-yield strain. [Result] Fermentation titer of shake-flask enhanced by 10% compared with the original strain. Passage test proved that this strain had stable genetic characteristics. [Conclusion] High lipase activity is used to screen the kitasamycin high-yield mutant strain, which shortens the breeding cycle, reduces the workload of preliminary screening, and enhances the efficiency of breeding.

Key wordsUV; Mutant strain; Kitasamycin; Lipase

基金項目國家自然科學基金NSFC-河南人才培養聯合基金項目(U1304104)。

作者簡介劉守強(1967- ),男，河南駐馬店人，高級工程師，從事抗生素發酵工藝研究。

收稿日期2016-03-08

中圖分類號TQ 465

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)12-005-02