新型復合誘變法篩選高產1,3-丙二醇菌株

于云娟，　李兆坤，　劉　妍，　續丹丹，　王鳳寰

北京工商大學，北京 100048

新型復合誘變法篩選高產1,3-丙二醇菌株

于云娟，李兆坤，劉妍，續丹丹，王鳳寰*

北京工商大學，北京 100048

摘要：為提高肺炎克雷伯氏菌生產1,3-丙二醇的能力，使用一種新型的以氮氣為工作氣體的等離子體復合紫外的誘變系統(MPMS-UV)對菌種進行誘變。用含有90 g/L ～100 g/L 1,3-丙二醇的選擇培養基進行篩選馴化，最終獲得一株高產PDO且甘油利用率高的優良菌株k2。2 L批式流加發酵結果表明，該菌株PDO產量為69.71 g/L，摩爾產率為0.57 mol/mol，比原始菌株分別提高了44.7%和21%。

關鍵詞：1,3-丙二醇； 紫外復合等離子體誘變系統； 發酵

1,3-丙二醇(PDO)是聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)的合成前體。PTT是一種新型的聚酯纖維材料。作為時裝材料，PTT具有良好的伸展性、柔韌性、抗皺性及易加工性，因此在服裝材料領域有巨大的市場前景。目前全球65%的PDO是采用化學法合成[1]，但化學合成法存在一些問題：對設備有高壓和高溫的要求、反應過程中需使用昂貴的催化劑、釋放有毒的中間體、依賴不可再生材料、低產量和復雜性等[2]。1881年Fzeund提出了甘油發酵PDO，之后由于生物法發酵PDO成本低、污染少、條件溫和等優點，得到了大家廣泛的認可[3]。Du Pont利用基因工程手段獲得工程菌E.coli，以葡萄糖為初始底物發酵生產PDO[4]，并取得了很大的進展，處于世界領先水平；我國雖然起步較晚，但發展非常快。盛虹集團與清華大學合作開發，采用生物柴油副產物甘油作為主要原料，5萬噸/年項目于2013年 5月開工建設[5]。

采用微生物法生產PDO關鍵在于菌株。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumonia)產PDO能力強，周期短，效率高，是現在研究的熱點。但是該菌株存在底物和產物抑制的問題[6]，這是利用微生物法發酵PDO難題的關鍵之一。目前獲得優良菌株的方法包括用基因工程手段來定向改造菌株代謝途徑[7]；利用物理、化學手段對菌株進行誘變。常用的物理方法有紫外誘變、等離子體誘變等；常用的等離子體誘變包括介質阻擋放電等離子體[8]、常溫常壓等離子體ARTP等，本實驗所采用的是一種新型的物理方法——紫外復合等離子體誘變方法(MPMS-UV)。MPMS所使用的工作氣體是氮氣，取代了ARTP所使用的高成本的氦氣，同時結合紫外照射，這樣可以有效增加突變率；同時也具有操作簡單、成本低、無毒無害等特點，是一種適合現代工業需求的育種方法。實驗使用紫外復合等離子體來誘變菌株，經過多次篩選、馴化和發酵最終挑選出優良菌株，為將來發酵PDO提供良好菌株和為發展等離子體誘變系統提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

菌株：肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniakp-13(由北京生物加工過程重點實驗室提供)

主要試驗儀器：恒溫搖床(太倉市實驗設備廠)，恒溫培養箱(上海一恒科學實驗有限公司)，多功能等離子體誘變系統(北京艾德豪克國際技術有限公司)，高效液相色譜(島津有限公司)，2L全自動發酵罐(鎮江東方生物工程設備技術公司)。

種子培養基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 5，酵母粉 5，pH 7.0。

選擇培養基(g/L)：蛋白胨10，NaCl 5，酵母粉 5，PDO 90/100，瓊脂 15(固體)，pH 7.0。

發酵培養基(g/L)：K2HPO4·3H2O 3.4，KH2PO41.3，(NH4)2SO44，MgSO40.24，CaCl20.1，葡萄糖 2.5，酵母粉 3，甘油 20，富馬酸 0.025，微量元素 1mL，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1培養條件

搖瓶培養條件：250 mL搖瓶裝液量100 mL，接種量1%，溫度37 ℃，轉速200 r/min，培養時間10 h。

發酵罐培養條件：初始發酵培養液體積1.6 L，接種量10%，發酵溫度37 ℃，轉速300 r/min，初始甘油濃度25 g/L，補料液配方：70%甘油、10%葡萄糖、20%水，用4 mol/L KOH調節pH為7.0，發酵時間30 h。

1.2.2誘變處理

等離子體誘變參數：99.99%及以上氮氣，氣體流量12.05 slpm，誘變距離20 mm，溫度25 ℃，垂直照射；紫外誘變：距離30cm，波長254 nm，功率300 W，斜45°照射。

將原始菌株活化傳代2次后接種于100 mL的搖瓶中進行培養，待菌體生長到對數期時進行稀釋，稀釋到大約108個/mL，菌懸液制備完畢。取制備好的菌懸液15 μL，放入誘變系統中，打開紫外燈并注入氮氣同時進行誘變。誘變的時間選取致死率為95%左右的時間點。復合誘變后，將菌液從處理室取出，稀釋適當倍數涂布于1,3-丙二醇濃度為90 g/L的選擇培養基平板上在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h。

1.2.3菌種篩選與馴化

挑取在選擇培養基中體積較大長勢較好的菌落，劃線到PDO濃度為100 g/L的選擇培養基上進行二次篩選，將體積長勢較好的菌落轉接到與選擇培養基相同濃度PDO的搖瓶中多次培養馴化?？疾旄鲹u瓶菌株的生物量、產物濃度，最后挑選最優菌株進行發酵罐實驗[7, 9]。

1.2.4發酵實驗及發酵參數測定

篩選后的優良菌株進行2 L補料批式發酵實驗，每2 h取樣1次，在600 nm下測定吸光值，測定甘油濃度，根據所得甘油濃度調節補料流加速度，使罐內甘油濃度保持在15 g/L ～20 g/L。發酵完畢后用高效液相色譜測定發酵液中底物、代謝產物等有效成分的含量。實時測量發酵罐內甘油含量采用高碘酸鈉氧化法；產物濃度使用島津高效液相色譜分析，檢測器為RID示差檢測器，色譜柱為Bio-Rad 公司Amines HPX-87H 有機酸離子交換柱，柱溫65 ℃，流動相為 5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 ml/min。樣品分析前經0.45 μm 微濾膜過濾。

2結果與討論

2.1誘變致死率

對菌株進行不同時間的復合誘變，計算致死率，結果如表1所示。隨著誘變時間增加，致死率也增加，當誘變時間為40 s時致死率為100%，誘變20 s時致死率為93%，因此選擇誘變時間20 s。

表1　復合誘變致死率

2.2搖瓶發酵

第一次使用PDO濃度為90 g/L的平板初步篩選出25個菌落體積較大的菌株，將這25個菌落涂布于PDO濃度為100 g/L的平板上復篩。有8個菌落體積較大，長勢良好，將這8株菌命名為k1-k8。經傳代馴化搖瓶培養后，突變菌株的生物量與PDO含量均比原始菌株高，其中 k2、k4、k7的生物量和PDO的含量明顯高于其他突變菌(圖1)，OD值分別為6.85、6.89、6.98；PDO分別為11.212 g/L、10.812 g/L、12.013 g/L；k7的生物量和PDO的含量是最高的。

圖1　誘變后各搖瓶生物量及PDO含量

K.pneumonia甘油代謝途徑包括還原途徑和氧化途徑，PDO代謝屬于還原途徑；氧化途徑會產生一些主要的副產物，如乙酸、乳酸、乙醇等(圖2)，這些副產物的合成過程會對主產物PDO的合成造成一定影響。由于副產物乙酸不消耗NADH，并且提供ATP，因此乙酸的合成有利于合成PDO；而副產物乳酸、乙醇等消耗NADH，與PDO形成競爭關系，因此乳酸與乙醇等的合成不利于PDO的合成。對于k2和k4，由圖3看出，k2的 pH值下降較k4多，表明產酸較k4多，由此可以推斷PDO產量可能會較多。另從圖4看到，k2甘油的消耗量也較k4多，表明k2菌株的性能可能優于k4。

①甘油脫水酶(GDHt)；②1,3-丙二醇氧化還原酶(PDOR)；③甘油脫氫酶(GDH)；④二羥基丙酮激酶(DHAK)

圖2Klebsiellapneumonia甘油代謝途徑

2.32 L發酵實驗

將搖瓶實驗中PDO產量最高的兩株菌k2、k7以及原始菌株進行2L發酵罐實驗，結果如圖5所示。誘變后的兩株菌的生物量(OD600)比原始的菌株都要高，其中k7的OD值最高可達18.1，而原始菌株最高OD值是15.2，增加了19%。k2的OD值最高是16.2，相對原始菌株增加了6.5%。產物PDO如圖6所示，k7的產量是67.87 g/L，原始菌株PDO的最終產量是48.19 g/L，k7相對原始菌株增加了40.8%；k2的產量是69.71 g/L，增加了44.7%。

圖3　pH變化值

圖4　甘油消耗量

圖5　k2、k7與原始菌株生物量的比較

圖6　k2、k7與原始菌株PDO含量的比較

原始菌株與誘變菌株的最終發酵參數如表2所示，可以看出，k2的生物量不如k7的高，但是PDO的產量卻高于k7，k2的生物量比k7低了10.5%，但PDO的產量卻高了2.7%，這說明k2產PDO的能力強于k7。

如表2所示，原始菌株乙酸的最終產量是4.53g/L，相對PDO的含量是9.4%。誘變后k2、k7乙酸的產量分別是8.66 g/L、7.51 g/L，相對PDO的含量是12.42%、11%，由此看到誘變后菌株乙酸的產率增加，且k2高于k7。由圖7可以看到，菌株在發酵的過程中，副產物乙酸的合成主要是菌株對數生長期合成積累。在發酵初期以對數形式增長，到發酵中期12 h左右會達到峰值，繼續發酵產量會有所下降，增長趨勢與PDO一致。

表2　批式發酵結果

原始菌株乳酸的最終產量是22.14 g/L，相對PDO的含量是45.9%，誘變后k2、k7乳酸的產量分別21.53 g/L、27.3 g/L，相對PDO的含量是30.9%、40.2%，k2低于k7。圖8顯示，副產物乳酸是在發酵后期增加積累，在發酵的前12 h增長比較緩慢，到12 h以后開始大量合成，到24 h后進入緩慢期。乳酸的合成不利于PDO的合成。有相關研究表明，敲除編碼乳酸脫氫酶的基因片段ldhA不會影響菌體生長代謝，菌濃度未有變化[10]。

圖7　副產物乙酸發酵結果

k2、k7菌株副產物2,3-丁二醇(2,3-BD)的產量明顯高于原始菌株(圖9)，且起始合成時間也提前了，原始菌株在發酵16h開始合成，而k2、k7在發酵10h開始合成且k7高于k2。生成2,3-BD雖需還原當量，但其生成量對PDO的產量影響不大，并且2,3-BD是一種重要的化工原料和液體燃料，在化工、食品、燃料及航空航天等領域有很廣泛的應用[11]。因此2,3-BD產量的增加對工廠的實際效益是有益的。有研究表明敲除乳酸支路還會有利于2,3-BD的生成量[12]。

圖8　乳酸發酵產量

圖9　2,3-丁二醇的發酵產量

K.pneumonia在誘變后可能會出現退化現象，不能穩定遺傳誘變后的優良性能。解決這一問題可以從下面兩個方面解決。一是用含高濃度PDO的培養基進行多次培養。PDO雖對菌株有抑制作用，但該菌種產PDO的能力與其對PDO的耐受力成正相關。用高濃度PDO的選擇培養基來進行多次培養馴化，可以使菌株對這種特殊環境的適應性更強；另外馴化的過程又起到進一步篩選的作用。二是選擇良好的保菌方式非常重要。本實驗采用低溫冷凍法保藏菌種，將菌株放入一定比例的甘油管中，放入-80 ℃的超低溫冰箱中進行保藏。

副產物乙酸、乳酸的產量與PDO的產量之間的關聯十分明顯，乙酸與PDO成正相關，乳酸與PDO成負相關。本實驗沒有詳細考察副產物乙醇與PDO的關系，有文獻記載乙醇與PDO也是成負相關的。這些副產物對PDO的生成有很大的影響，是評定一株菌種是否優良的重要參數[13-16]。后續實驗計劃考察乙醇、琥珀酸等副產物以及產PDO的關鍵酶活與1,3-丙二醇產量的關系，從代謝途徑、代謝流節點代謝通量和副產物產量綜合分析菌種的各項性能，以求挑選出更優更適合生產的菌種。

3結論

采用紫外復合等離子體誘變技術對K.pneumonia進行誘變，用PDO濃度為90 g/L～100 g/L的選擇培養基對誘變后的菌株進行培養篩選。通過發酵產物，如乙酸、乳酸、2,3-BD等產量與PDO產量之間的關系，以及菌株生物量和甘油消耗量的研究確定優良菌株。最終獲得一株優良菌株k2。2 L批式流加發酵結果表明：該菌株PDO產量為69.71 g/L，摩爾產率為0.57 mol/mol，生產強度為0.8 g/L·h，較原始菌株分別提高了44.7% 、21%和11.3%；副產物乙酸含量為8.66 g/L，較原始菌株提高了91.16%；乳酸產量為21.53 g/L，較原始菌株降低2.76%；2,3-BD含量為14.83 g/L，較原始菌株提高了151.3%。

參考文獻

[1]沈瑤瑤,于建榮,毛開云. 生物基1,3-丙二醇技術開發及產業發展趨勢[J].生物產業技術, 2014,(4):38-43.

[2]Kaur G, Srivastava AK, Chand S. Advances in biotechnological production of 1,3-propanediol [J]. Biochemical Engineering Journal, 2012, 64:6-8.

[3]Maervoet VET, Mey MD, Beauprez J,etal. Enhancing the microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol using metabolic engineering[J]. Organic Process Research & Development,2011,15(1):189-202.

[4]吳從意, 陳靜. 1,3-丙二醇制備研究進展[J].分子催化, 2012, 26(3):276-283.

[5]張麗. 我國1,3-丙二醇-聚對苯二甲酸丙二醇酯產業鏈發展形勢[J].化學工業, 2014,32(6):7-8.

[6]張宏蕊,金平,劉樹臣. 發酵產1,3-丙二醇的關鍵酶研究進展[J].化學與生物工程, 2011,28(3):1-4.

[7]Celińska E.Klebsiellaspp. as a 1, 3-propanediol producer-the metabolic engineering approach[J]. informa healthcare, 2011,19.

[8]Dong XY, Xiu ZL, Li S,etal. Dielectric Barrier Discharge Plasma as a Novel Approach for Improving 1,3-Propanediol Production inKlebsiellapneumonia[J]. Biotechnol Lett, 2010, 32(9): 1245-1250.

[9]侯英敏. 等離子體誘變生產1,3-丙二醇菌種的研究[D]. 碩士學位論文.大連理工大學,2006:26.

[10]周佳佳,高黎榮,劉龍飛等.D-乳酸合成阻斷對肺炎克雷伯氏菌的1，3-丙二醇發酵的影響[J].工業微生物, 2014, 44(4):24-27.

[11]戴建英,孫亞琴,孫麗慧等.生物基化學品2,3-丁二醇的研究進展[J].過程工程學報, 2010,10(1):200-207.

[12]Yang,G., Tian J S, li J. Fermentation of 1,3-propanediol by a lactate deficient mutant ofKlebsiellaoxytocaunder microaerobic conditions[J]. Appl Microbiol Biotechnol,2007,73(5):1017-1024.

[13]徐衛濤,鐘志輝,付水林等. pH值對克雷伯氏肺炎桿菌發酵甘油產1,3-丙二醇的影響與控制[J].化學與生物工程,2011,28(8):81-83.

[14]唐廣明,徐佳杰,徐衛濤等. 高產1,3-丙二醇菌株的誘變與篩選[J].化學與生物工程, 2010,27(3):46-50.

[15]Skraly FA, Lytle BL, Cameron DC. Construction and characterization of a 1,3-propanediol operon[J]. Appl. Environ. Microbiol, 1998, 64(1): 98-105.

[16]Wang LY, Huang ZL, Li G,etal. Novel Mutation Breeding Method forStreptomycesavermitilisUsing an Atmospheric Pressure Glow Discharge Plasma [J]. J Appl Microbiol, 2010, 108(3): 851-858.

New combined mutagenesis for screening of high-yielding 1,3-propanediol strains

YU Yun-juan， LI Zhao-kun， LIU Yan， XU Dan-dan， WANG Feng-huan

Beijing Technology and Business University, Beijing 100048

AbstractIn order to improve the 1,3-propanediol production of Klebsiella pneumoniae, the multi-function plasma mutation and ultraviolet system(MPMS-UV)were performed for strain mutagenesis using nitrogen as working gas. The strains were screened using the selection culture medium with 90～100 g /L of 1,3-propanediol. Ultimately, a mutant strain k2 with high 1,3-propanediol yield and glycerol utilization was obtained. In 2 L fed-batch fermentation, the strain K. pneumoniae k2 could produce 1,3-propanediol as high as 69.71 g/L with high conversion rate of 0.57, which were 44.7% and 21% higher than those of the parent strain, respectively.

Key words1,3-propanediol; MPMS-UV combined mutagenesis; fermentation

基金項目：北京市青年英才計劃(YETP1450)。

作者簡介：于云娟(1990～)，女，碩士。 E-mail：yyjuan1050@foxmail.com。 *通訊作者：王鳳寰(1978～)，男，博士，副教授。E-mail：wangfenghuan@th.btbu.edu.cn。