低頻電磁輻射對小鼠近日節律的影響*

楊運康　劉延友　后望　王正榮

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院· 衛生部時間生物學研究室， 四川 成都 610041)

·論著·

低頻電磁輻射對小鼠近日節律的影響*

楊運康劉延友后望王正榮△

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院· 衛生部時間生物學研究室， 四川 成都 610041)

【摘要】目的探究2000μW/cm2電磁輻射對小鼠運動節律和Clock基因表達水平的影響。方法將4周齡的雄性昆明鼠30只隨機分為三組：空白組，1h/d輻射組，2h/d輻射組。固定小鼠，使其接受2000μW/cm2電磁輻射，連續10天，之后監測其轉輪活動的近日節律變化，并且提取小鼠腦組織中的總RNA和蛋白， RT-PCR和western-blot檢測三組之間Clock基因和蛋白的表達是否存在顯著性差異。結果與空白組相比，兩個輻射組小鼠近日節律均有縮短的現象(P<0.05)，且Clock基因和蛋白的表達水平顯著性的升高(P<0.05)。結論2000μW/cm2電磁輻射會縮短小鼠的近日節律周期，其機制可能與Clock基因表達升高有關。

【關鍵詞】電磁輻射；近日節律；生物鐘基因；Clock基因

近日節律是機體適應環境周期性變化的一種內在機制，具有重要的生理功能[1]。分子水平上，近日節律是由一系列的核心近日鐘基因的轉錄負反饋環路所產生，近日鐘基因參與調控細胞的生理生化活動，如細胞增值、細胞凋亡等[2，3]。隨著科技的進步，電磁波的應用也得以普及，它在給人類的日常生活帶來便利的同時，也帶來了許多的弊端，各個種類的電子產品所發射出的電磁波不僅對地球和大氣帶來破壞，更嚴重的是影響到了人體的健康[4，5]。有研究報道，2000μW/cm2電磁輻射可導致小鼠學習記憶功能下降，其機制可能與海馬體組織蛋白及其mRNA的表達下降有關[6]。低強度微波輻射(150μW/cm2)能通過影響雄性小鼠血清總膽固醇含量、 睪丸組織P450scc mRNA的表達，影響血清睪酮的合成和分泌，進而影響雄性小鼠生殖系統的其他相關指標[7]。低強度電磁輻射影響大鼠松果體中第二信使cAMP, cGMP，從而干擾松果體細胞信號轉導系統，進一步影響動物的晝夜節律[8]。生物節律系統在維持生物體內環境穩態，保證生物體日常生理活動正常進行方面具有重要作用，而相關的節律基因則處于該系統的核心位置。Clock是節律調控通路中最核心的元件[9-11]，電磁輻射對生物節律的影響還少有報道，本文主要探討電磁輻射對生物的近日節律和生物鐘基因的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動物昆明小鼠30只，4周雄性，購于四川大學華西校區實驗動物中心。

1.1.2主要試劑Trizol 試劑(美國，Inxitrogen)， DEPC(美國，Sigma)，PCR Mix(中國，novoprotein)，DNA Leader2000(中國，novoprotein)，HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(北京，康為世紀)，RIPA蛋白裂解液(中國，碧云天)，預染蛋白Marker(美國，Fermentas)，ECL檢測試劑盒(中國，全式金)，CLOCK抗體(美國，Epitomics)，抗GAPDH抗體(中國，康為)，辣根酶過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體(中國，中杉金橋)辣根酶過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG抗體(中國，中杉金橋)其它試劑為國產分析純。

1.1.3主要儀器普通PCR儀(德國，Eppendorf)，低溫離心機(德國，Eppendorf)，微量移液器(德國，Eppendorf)，瓊脂糖凝膠電泳槽裝置(中國，俊逸)，轉輪裝置節律監測儀，電磁波發生器等。

1.1.4引物序列引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，引物序列見表1。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1動物分組及飼養將30只4周齡的雄性昆明鼠，飼養于24小時全黑環境，自由飲水進食，溫度為22～24℃，濕度50～65%，控制環境噪音。飼養兩周時間，使小鼠適應周圍環境，利用小鼠節律檢測儀監測每只小鼠的轉輪活動，待其跑出有規律且穩定的近日活動圖后，將小鼠隨機分為3組：對照組，1h/d輻射組，2h/d輻射組。

1.2.2輻射處理對其中兩組分別采用2000μW/cm2強度的電磁波進行每天1小時和2小時輻射，用鼠板固定小鼠，輻射探頭置于小鼠頭部正上方，范圍為以探頭為圓心，半徑15cm的圓形區域，小鼠全身接收照射。1h/d輻射組輻射時間為上午8:00～9:00，2h/d輻射組為上午8:00～10:00，連續輻射10天；對照組小鼠每天8:00～10:00固定2小時，不做輻射處理。

1.2.3活動節律監測采用轉輪裝置自輻射前5日起至輻射結束后連續監測小鼠自發主動活動變化，搜集數據與對照組進行比較分析。

1.2.4RT- PCR用液氮將腦組織充分研磨后，加入Trizol試劑，按照說明書提取組織的RNA，檢測RNA的濃度和質量。按照逆轉錄試劑盒的說明書，將上述RNA逆轉錄為cDNA。根據PCR mix提供的說明書，配置反應體系進行PCR實驗，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶。

1.2.5Western blot用液氮將腦組織充分研磨后，加入RIPA(強)裂解液，按照說明書的操作流程，提取組織的總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并且將蛋白轉膜到PVDF，western-blot檢測三組CLOCK和GAPDH蛋白的表達水平。

1.2.6數據分析Quantity one軟件半定量分析條帶的相對光密度值；利用SPSS軟件對三組樣品的相對單位光密度值進行獨立樣本t檢驗，P<0.05表示兩組間差異有統計學意義。

2結果

2.12000μW/cm2電磁輻射對小鼠近日節律的影響實驗組小鼠接受輻射前后的自發主動活動節律圖如圖1所示，其中箭頭所示為輻射開始時間，A為每天接受2000μW/cm2低強度電磁波輻射1小時，輻射時間為上午8：00-9：00，連續輻射10天，B為每天接受2000μW/cm2低強度電磁波輻射2小時，輻射時間為上午8：00～10：00，連續輻射10天，C為對照組沒有進行輻射處理。從圖中可以看出，輻射前兩組實驗組節律周期與對照組相比沒有顯著差異(P>0.05);而輻射后，兩組輻射組小鼠的近日節律周期均比對照組短(P<0.05)，1h/d輻射組和2h/d輻射組小鼠近日節律無顯著差異(P>0.05)。

2.22000μW/cm2電磁輻射對小鼠Clock基因表達量的影響圖2是對1h/d輻射組和2h/d輻射組進行輻射處理后，利用RT-PCR檢測輻射組和對照組小鼠clock mRNA表達的結果，其中圖2A中1、2、3條帶是1h/d輻射組，4、5、6是2h/d輻射組，7、8、9是對照組，圖2B為三組相對光密度，對照組為1.2±0.2，1h/d輻射組為2.8±0.2，2h/d輻射組為3.1±0.2。由圖可知，兩組實驗組小鼠clock表達均顯著高于對照組，存在顯著差異(P<0.05)，而1h/d輻射組和2h/d輻射組兩組無顯著差異(P>0.05)。

2.3Western Blot檢測輻射后實驗組和對照組小鼠CLOCK表達圖3是對1h/d輻射組和2h/d輻射組進行輻射處理后，利用western blot檢測輻射組和對照組小鼠CLOCK表達的結果，其中圖3A中分別為對照組、1h/d輻射組和2h/d輻射組的結果，圖3B為三組相對光密度，對照組為1.6±0.2，1h/d輻射組為3.2±0.2，2h/d輻射組為3.6±0.2。由圖可知，兩組實驗組小鼠CLOCK表達均顯著高于對照組，存在顯著差異(P<0.05)，而1h/d輻射組和2h/d輻射組兩組無顯著差異(P>0.05)。

圖1三組小鼠自發主動活動節律圖

Figure 1The self-sustained locomotor circadian rhythm of mice

圖2RT-PCR檢測輻射后實驗組和對照組小鼠Clock表達

Figure 2The relative mRNA level of Clock

3討論

本次試驗以小鼠為研究對象，研究2000μW/cm2強度低頻電磁波輻射對近日節律的影響，實驗結果表明，每天接受1小時和2小時2000μW/cm2強度低頻電磁波持續輻射10天，會顯著性的縮短小鼠的自發主動活動節律周期，同時會顯著性的增加clock 基因mRNA和蛋白的表達水平。

Clock是生物體的核心近日鐘基因，與Bmal1一起構成負反饋環路的正性元件[12]。給予小鼠2000μW/cm2強度低頻電磁波輻射，會增加Clock的表達水平，同時會縮短小鼠的運動近日節律的周期，說明小鼠近日節律的縮短可能與Clock的表達水平增加有關。

圖3western blot檢測輻射后實驗組和對照組小鼠CLOCK表達

Figure 3The relative protein level of CLOCK

目前，已有大量研究證明哺乳動物體內存在由核心近日鐘基因所構成的核心通路和輔助通路[13]，參與調控機體的各項生理活動[14]。研究報道，動物體內Clock基因表達出現異常時，會導致體內多種細胞的活力顯著下降，而且體內免疫細胞數目也會降低[15]。

哺乳動物體內的近日鐘具有核心的負反饋環路， CLOCK和BMAL1兩種蛋白質所構成的異二聚體可以結合在mPer1/2/3、Cry1/2基因上游的E-box區域，促進了mPer、Cry基因的轉錄[16,17]，當細胞質內PER、CRY蛋白的濃度增加到一定的程度，又會反過來抑制CLOCK:BMAL1二聚體的活性，從而抑制的mPer、Cry的轉錄，構成負反饋環路，形成周期約為24小時的節律振蕩[18]。本實驗中，輻射組的近日節律周期比對照組顯著縮短，同時Clock基因表達顯著上升，故推測低頻電磁波輻射導致小鼠腦組織中Clock基因表達的上升，影響了核心的負反饋環路，從而改變了近日振蕩周期。

近日節律系統是機體適應環境周期性變化的一種內在機制，改變節律基因的表達水平是近日節律參與調控機體生理活動的重要的手段之一[19,20]。本研究發現，經過10天持續的2000μW/cm2強度低頻電磁波輻射后，小鼠的近日節律周期縮短，而Clock的表達有明顯的上升，證明了低頻電磁波會影響生物體的近日節律系統，而其中涉及到的分子機制值還需要更加深入的研究探討。

4結論

本實驗研究結果發現， 2000μW/cm2強度低頻電磁波輻射影響小鼠的近日節律，表現為小鼠的運動節律周期縮短，小鼠腦組織中clock 基因mRNA和蛋白的表達水平升高，推測低頻電磁波輻射，可能通過改變clock 基因的表達水平影響小鼠的自發主動運動節律的周期。揭示了低頻電磁輻射對生物體近日節律的影響機制，證明日常生活中存在的各種電磁輻射會影響人體的健康。

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The effect of low frequency electromagnetic waves on the circadian rhythm in mice

YANG Yunkang, LIU Yanyou, HONG WANG, et al

(KeyLaboratoryofChronobiology,MinistryofHealth(SichuanUniversity),WestChinaSchoolofPreclinicalandForensicMedicine,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the influence of 2000μW/cm2 electromagnetic radiation on the circadian rhythm and the expression level of Clock in mice. Methods30 male Kunming mice were randomly divided into control group, 1h/d radiation group and 2h/d radiation group. Mice in radiation group were fixed and accepted 2000μW/cm2 electromagnetic radiation for 10 days. Biological rhythm monitor was used to detect the locomotor circadian rhythms of mice. Total RNAs and proteins of brain tissue were extracted. RT-PCR and western-blot were used to detect the expression level of mRNA and protein. ResultsThe period of the circadian rhythm in the two radiation groups were shorter than that of control group (P<0.05), and the mRNA and protein level Clock were both increased, when compared with that of control group (P<0.05). Conclusion2000μW/cm2 electromagnetic radiation could shorten the period of circadian rhythm in mice, which might be associated with the increased expression of Clock.

【Key words】Electromagnetic radiation; Circadian rhythm; Clock gene

基金項目：國家自然科學基金(31371180)

通訊作者：王正榮，教授，本刊常務編委，E-mail：wangzhengrong@126.com。

【中圖分類號】R 318.03

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.011

(收稿日期：2016-01-19； 編輯： 張文秀)