毛萼乙素通過調節STAT3抑制宮頸癌C-33A細胞survivin的表達*

齊玉明　王春麗　馮社軍

(邯鄲市中心醫院　1.婦二科，2.神經內二科， 河北 邯鄲 056001)

·論著·

毛萼乙素通過調節STAT3抑制宮頸癌C-33A細胞survivin的表達*

齊玉明1王春麗1馮社軍2

(邯鄲市中心醫院1.婦二科，2.神經內二科， 河北 邯鄲 056001)

【摘要】目的觀察毛萼乙素(Eriocalyxin B, ERB)對于宮頸癌C-33A細胞增殖的調節作用和對survivin表達的調控作用，及其相關的分子機制。方法使用不同濃度的毛萼乙素(0μM、1μM和20μM)對宮頸癌C-33A細胞進行干預。在不同時間點(0h、24h和48h)使用MTT法對C-33A細胞活性進行測定。在干預48h后，采用qPCR對C-33A細胞survivin mRNA的表達水平進行檢測。采用western blot對C-33A細胞survivin蛋白表達水平和STAT3磷酸化水平進行檢測。結果與0μM干預組相比，給予毛萼乙素干預的宮頸癌C-33A細胞活性呈時間依賴性和濃度依賴性下降，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。在毛萼乙素干預48h后，宮頸癌C-33A細胞survivin mRNA和蛋白的表達水平及STAT3的活化水平呈濃度依賴性降低，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05)。結論毛萼乙素可能可以通過下調宮頸癌C-33A細胞survivin的表達對腫瘤細胞的增殖產生抑制作用，該機制與降低STAT3的活化密切相關，且為毛萼乙素應用于宮頸癌及其他惡性腫瘤的臨床治療奠定了一定的實驗基礎。

【關鍵詞】宮頸癌；C-33A細胞；毛萼乙素；STAT3；survivin

宮頸癌(cervical cancer)是女性最常見的惡性腫瘤之一，其流行病學研究證實發病率居第四位，同時部分數據顯示宮頸癌有年輕化的趨勢[1-4]。毛萼乙素(Eriocalyxin B, ERB)作為一種二萜類化合物(diterpenoid)，主要來源于唇形科植物毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx)[5-11]。近年研究發現毛萼乙素具有調節免疫細胞分化、抑制腫瘤細胞增殖和抑制炎癥反應等多種的藥理作用和生物活性[12-14]。毛萼乙素的多種生物活性與阻斷STAT3的活化密切相關[15]。本研究旨探討毛萼乙素對于宮頸癌C-33A細胞的抑制作用及其潛在的分子機制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料第一鏈qPCR試劑盒購于日本Takara公司；iQTM5 Multicolor Real-Time PCR Detection System購買于美國百樂公司；鼠抗人survivin抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體購于Santa Cruz公司；毛萼乙素購買于美國Sigma公司；DMEM培養基購買于美國Gibco公司； MTT試劑盒購買于美國Promega公司；其余試劑均為分析純。

1.2細胞培養宮頸癌C-33A細胞常規接種在含10% FBS、100g/L 青霉素、100g/L鏈霉素的DMEM培養液中，置于37°C、95%空氣、5 % CO2孵箱內培養。每48 h換液、傳代1次，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3細胞活性檢測取對數生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96 孔培養板中，每孔接種100 μL約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養細胞16h至24h，使細胞同步化。加入不同終濃度(0μM、1μM和20μM)的毛萼乙素，在37℃，5 % CO2條件下培養細胞，0μM干預組細胞作為對照組。使用MTT比色試驗對不同時間點(0h、24h和48 h)的細胞生長狀態進行測定，實驗重復4次。對應時間點的細胞活性(%)=(OD干預組/OD對照組) × 100 (%)[16]。

1.4細胞survivin mRNA表達檢測按照試劑盒說明書提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行qPCR反應。5′-CATGGG TGCCC CGACGTTG-3′，反義5′-GCTC CGGCCAGAGGC CTCAA-3′；β-actin正義：5′-TGGC ATTGCC GACAGGAT-3′，反義：5′-GCTCA GGAGGAGCAA TGATCT-3′。使用β-actin作為內參基因，使用2-ΔΔCT公式計算目的基因相對表達量。ΔΔCt = (Ct,目標-Ct,β-actin)干預組-(Ct,目標-Ct,β-actin)對照組[17]。

1.4Western blot法檢測細胞中survivin蛋白表達水平和STAT3磷酸化水平按照試劑盒操作要求，首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時，分別加入鼠抗人單克隆抗體鼠抗人survivin抗體、鼠抗人phospho-STAT3抗體、鼠抗人STAT3抗體和鼠抗人β-actin抗體，4℃孵育過夜，洗膜后加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統進行掃描。

1.5統計學方法計量資料以均數±標準差表示。采用SPSS 21.0進行單因素方差分析，兩樣本均數多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1MTT法結果分析在不同濃度(0μM、1μM和20μM)毛萼乙素干預后，使用MTT法對不同時間點(0、24和48小時) 宮頸癌C-33A細胞活性進行測定。發現給予毛萼乙素干預的宮頸癌C-33A細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，差異均具顯著統計學意義(P均<0.05)，見表1。

表1　MTT比色法測定C-33A細胞活性

注：對應時間點與0μM相比較①P<0.05，對應時間點與1μM相比較②P<0.05。

2.2Survivin mRNA和蛋白的表達在給予宮頸癌C-33A細胞不同濃度(0μM、1μM和20μM)毛萼乙素干預48小時后，使用qPCR和western blot法對細胞survivin mRNA和蛋白的表達進行檢測。與對照組細胞相比較，給予毛萼乙素干預的C-33A細胞survivin mRNA和蛋白表達水平呈濃度依賴性降低，差異均存在顯著統計學意義(P均<0.05)，見圖1和表2。

圖1宮頸癌C-33A細胞survivin蛋白表達的western blot結果

Figure 1The western blot result of the protein expression of survivin in C-33A cells

Table 2The mRNA and protein expression levels of survivin and the phosphorylation of STAT3 in C-33A cells

藥物濃度survivinmRNAsurvivin蛋白STAT3磷酸化水平0μM10.96±0.040.97±0.031μM0.63±0.21①0.69±0.18①0.73±0.17①20μM0.31±0.05①②0.23±0.07①②0.27±0.08①②

注：與0μM相比較①P<0.05，與1μM相比較②P<0.05。

2.3STAT3磷酸化水平在給予宮頸癌C-33A細胞不同濃度(0μM、1μM和20μM)毛萼乙素干預48h后，使用western blot法對細胞STAT3活化水平(phospho-STAT3/STAT3)進行檢測。與對照組細胞相比較，給予毛萼乙素干預后的宮頸癌C-33A細胞STAT3活化水平呈劑量依賴性降低，差異均有顯著統計學意義(P均<0.05),見圖2和表2。

圖2C-33A3細胞STAT3磷酸化的western blot結果

Figure 2The western blot result of the phosphorylation of STAT3 in C-33A cells

3討論

宮頸癌(cervical cancer)作為女性生殖系統的最常見的惡性腫瘤之一在我國有較高的發病率。據流行病學調查研究顯示我國宮頸癌的發病率高達7.5/10萬人，死亡率約為3.4/10萬人[1-3, 18]。研究顯示人類乳頭瘤樣病毒(human papilloma virus, HPV)感染作為宮頸癌發生最重要的危險因素使HPV感染者發生宮頸癌的機率比未感染者增加250倍以上[18, 19]。同時研究表明由于我國HPV感染率的上升導致宮頸癌的發病率亦有逐年增加的趨勢[18, 19]。故尋求新的抗宮頸癌的治療藥物和途徑具有重的價值與意義。

毛萼乙素(Eriocalyxin B, ERB)是唇形科藥用植物毛萼香茶菜(Isodon eriocalyx)的主要藥理成分之一[5-10]，為一種二萜類化合物(diterpenoid)，具有抑制炎癥反應、調節免疫細胞分化、抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡等在內的廣泛的藥理活性[5-15, 20]。Lu Y等研究發現毛萼乙素可以通過調節Th1細胞和Th17細胞的分化對自身免疫性腦脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)小鼠神經組織的炎癥反應有顯著的改善作用[12]。Li L等人通過動物實驗證實毛萼乙素對胰腺腺癌有顯著的抑制作用，且該抗腫瘤作用與毛萼乙素促進腫瘤細胞凋亡密切相關[13]。Zhang YW等也發現毛萼乙素可以通過促進腫瘤細胞的凋亡抑制淋巴瘤細胞增殖[20]。此外Leizer AL等的研究還證實毛萼乙素對TNF-α等炎癥介質的釋放有顯著的抑制作用[14]。我們使用毛萼乙素對宮頸癌C-33A細胞進行干預后，發現C-33A細胞活性呈濃度依賴性和時間依賴性下降，該結果表明毛萼乙素對于宮頸癌C-33A細胞增殖有顯著的抑制作用。

STAT3屬于STATs家族成員，在生理狀態下STATs廣泛參與了細胞周期、組織生長發育以及組織器官修復等過程[21-24]。近年研究發現STAT3信號通路對于非小細胞肺癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌和宮頸癌等多種腫瘤細胞的增殖分化及凋亡有重要的調控作用[21-23]。肉盤菌內酯(galiellalactone)可以通過下調STAT3的活化抑制前列腺癌DU145細胞移植瘤小鼠體內腫瘤細胞的增殖和轉移，并促進腫瘤細胞的凋亡[22]。Mukherjee A等的研究證實槲皮素(quercetin)主要通過IL-6/STAT-3信號通路誘導非小細胞肺癌A549細胞凋亡[23]。同時Yu X等的研究發現毛萼乙素可以通過阻斷STAT3信號通路抑制肝癌HepG2細胞、非小細胞肺癌A549細胞以及乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-468 細胞的增殖和轉移[15]。本研究發現與對照組細胞相比較，給予毛萼乙素干預后的宮頸癌C-33A細胞STAT3活化水平呈劑量依賴性降低。同時，我們還對STAT3下游調控腫瘤增殖分化的重要分子survivin的表達進行了分析[24]。實驗結果表明：在宮頸癌C-33A細胞中，毛萼乙素可以通過阻斷STAT3信號通路有效的抑制survivin的表達。

4結論

在宮頸癌C-33A細胞中毛萼乙素可能可以通過阻斷STAT3信號通路下調survivin的表達，并對腫瘤細胞的增殖產生顯著的抑制作用。該基礎實驗為毛萼乙素應用于宮頸癌及其他惡性腫瘤的臨床治療奠定了一定的實驗基礎。

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Eriocalyxin B reduces the cell proliferation via blocking the activation of STAT3 in cervical cancer C-33A cells

QI Yuming1, WANG Chunli1, FENG Shejun2

(1.TheSecondDepartmentofGynaecologyandObstetrics,HandanCentralHospital,HandanHebei, 056001; 2.TheSecondDepartmentofNeurology,HandanCentralHospital,HandanHebei, 056001)

【Abstract】ObjectiveTo study the anti-tumor property of Eriocalyxin B (ERB) in cervical cancer C-33A cells and its potential mechanism. MethodsThree different concentrations (0μM, 1μM and 20μM) of ERB were used in current study. At different time points (0h, 24h and 48h), MTT assay was performed to analyze the cell viabilities. The mRNA and protein expression of survivin were measured by qPCR and Western blot. Meanwhile, the phosphorylation of STAT3 was also observed by western blot. ResultsThe cell viabilities of cervical cancer C-33A cells were concentration-dependently and time-dependently reduced by ERB. Then, the mRNA and protein expression of survivin and the phosphorylation of STAT3 were all concentration-dependently suppressed by ERB in cervical cancer C-33A cells, after 48 hours of interventions. ConclusionERB inhibited the proliferation of cervical cancer C-33A cells and survivin expression likely via blocking of the activation of STAT3.

【Key words】Cervical cancer; C-33A cells; Eriocalyxin B; STAT3; Survivin

基金項目：河北省衛生廳重點科技研究計劃(20130359)

【中圖分類號】R 961

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.008

(收稿日期：2015-07-01； 編輯： 張文秀)