異種移植模型中血小板源生長因子改善人卵巢組織移植物微循環重建研究*

張曜耀　肖準　李尚為 　汪燕　康倍佳

(四川大學華西第二醫院婦產科生殖醫學中心， 四川 成都 610041)

·論著·

異種移植模型中血小板源生長因子改善人卵巢組織移植物微循環重建研究*

張曜耀肖準李尚為 汪燕康倍佳

(四川大學華西第二醫院婦產科生殖醫學中心， 四川 成都 610041)

【摘要】目的通過運用前期研究提出新型卵巢組織玻璃化冷凍方法，改善了卵巢組織間質和微血管存活狀況，在前期研究基礎上，對卵巢組織冷凍帶來的間質損傷在凍融后進行體外培養修復，培養中通過添加血小板源生長因子(PDGF)改善移植后血管重建過程。方法對3例患者的卵巢組織皮質片進行深低溫保存。將3例共24片卵巢組織片配對分為PDGF干預組和對照組，每組各12片組織，通過體外短期培養24小時并在培養期間在PDGF組添加100ng/μl的PDGF作為干預，觀測培養前后卵巢組織體外生長趨勢。將兩組卵巢組織移植到SCID小鼠皮下，兩周后將皮下組織取出，觀測組織血管重建情況，比較各組微血管密度計數以及組織生長活性及凋亡情況。結果在異種移植模型中通過免疫組織化學法檢測卵巢新生微血管提示，添加PDGF因子培養后的卵巢組織移植物新生微血管密度計數顯著高于普通培養條件下的卵巢組織移植物。同時采用免疫熒光方法原位檢測組織凋亡(TUNEL)情況表明添加PDGF因子培養后的卵巢組織移植物凋亡細胞比例與對照組相比顯著降低。結論我們首次在卵巢組織體外培養過程中短期添加PDGF促進卵巢血管生成。在異種移植模型中，我們發現添加PDGF因子的移植物微循環重建情況顯著改善，并且移植物凋亡情況與對照組顯著降低。以上結果為優化卵巢組織體外培養以及移植物微循環重建效果提供了新思路。

【關鍵詞】卵巢冷凍； 生育力保存；卵巢移植 ；微循環重建；PDGF

不孕不育是嚴重影響人們生活質量的疾病，其中很大比例為女性生育力的降低，如何維持、保存生育力是生殖醫學面臨的最大問題[1,2]。近年女性生育力保存問題備受學者關注。年輕的女性惡性腫瘤存活者。隨著腫瘤治愈率的提高，其存活情況得以改善的同時，具有細胞毒性的抗腫瘤治療常對卵巢造成不可逆的損傷,導致提前絕經和不孕[3-5]。此外，許多非腫瘤因素如免疫性疾病、染色體異常、盆腔感染、復發性卵巢良性囊腫，醫源性因素等可造成卵巢功能受損甚至引起卵巢早衰[6-9]。卵巢組織冷凍不需要使用促排卵藥物治療，不延誤惡性腫瘤患者的治療時機，不受年齡和婚姻狀況的限制，可能有望同時保存女性生育力和生殖內分泌功能。因此，相比較胚胎冷凍和卵子冷凍技術，卵巢組織冷凍更有優勢和前景[10,11]。

卵巢間質對卵巢組織片體外培養或移植后卵泡的支持和營養以及微循環的建立具有重要作用。在間質完整性的前提下，血管新生過程還與一系列血管生成調節因子相關。血管生成過程包括：細胞外基質的重建；內皮細胞遷移和增殖；新生血管腔形成；周圍細胞募集以穩定新生毛細血管以及最終的成熟血管形成。參與這一過程調控的因子呈網絡狀分布，其中正性調節因子主要為血管生成因子，包括血管內皮生長因子(VEGF)家族，成纖維細胞生長因子(FGF)家族和血管生成素，此外，還有其他通過上調 VEGF表達來促進血管生成的細胞因子如肝細胞生長因子(HGF),血小板源生長因子(PDGF),表皮生長因子(EGF)，轉化生長因子β(TGFβ)等以及基質金屬蛋白酶(MMP)家族。其中，血小板源生長因子(PDGF) 是由多種細胞產生的重要多肽生長因子,可促進結締組織細胞(如血管內皮細胞、平滑肌細胞)增殖等。近年來，體內外研究證實PDGF在腫瘤等組織中與血管生成作用密切相關。然而，PDGF是否能影響卵巢組織移植物的血管再生目前尚罕見報道。在本課題研究中，我們擬采用添加促進血管生成因子添加一些促進血管生成的細胞因子進行短期體外培養，以促進移植后卵巢組織新生血管生成，改善移植物微循環的及時建立和穩定性，通過形態學、凋亡檢測、微血管計數等方法評價PDGF改善間質存活和促進微循環建立的效果，為優化和改進女性生育力保存體系提供研究思路，為惡性腫瘤存活者以及其他卵巢早衰易患人群的生育力保存和構建人類卵子庫提供研究基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料選取我院婦科手術病人卵巢組織，共收集標本3例，病人年齡范圍為20～26歲，中位年齡23.7歲。均為子宮惡性腫瘤附件切除患者。收集送病理檢查后剩余部分卵巢皮質組織，病檢證實有癌細胞轉移至卵巢者剔除。本研究涉及人體標本收集過程以及知情同意書經四川大學倫理委員會以及四川大學華西第二醫院倫理委員會專家審核批準。

1.2實驗方法

1.2.1標本收集將卵巢組織標本放入含10%FBS的L-15培養液中，放置于冰盒中在10分鐘內轉移至實驗室，在無菌超凈工作臺內，更換新鮮培養液，在培養液中快速用眼科剪剔除卵巢組織髓質后，將厚約1mm的卵巢組織皮質塊分割成面積約為2～3mm2大小的組織小塊，每例患者標本隨機等量分配到新鮮組及不同冷凍方法組。每例卵巢組織標本可分割為約10片組織小塊，術后經病理學專家證實所取標本均無癌細胞卵巢轉移。冷凍方法分為玻璃化冷凍(NIV法)，其中每一例收集凍存的標本均留取少許組織固定，包埋，切片，染色進行形態學分析，進行了基本的解凍復蘇后冷凍效果評價。

1.2.2NIV冷凍NIV冷凍法為本課題組首創的新型玻璃化冷凍方法，在該方法中，采用了一種特殊載體——超細針灸針。針灸針為我國傳統醫療器械，它由針臂和針體兩部分組成。本實驗中采用直徑為0.18 mm，長為20 mm 的針。具體操作：在標本收集液中將人卵巢組織片每3～4片穿于一根針體上，室溫下用鑷子鉗夾針臂端放入平衡液 B：7.5%(v/v) DMSO+7.5% (v/v) EG 10分鐘；再放入冷凍液 B：15% DMSO+15% EG+0.5 M sucrose 2分鐘。組織經過脫水后，用消毒紗布輕輕吸去組織周圍剩余的冷凍保護劑，以減少保護劑體積，再同時鉗夾多根針臂快速浸入裝有液氮的金屬容器中，并在液氮中將針和組織裝入充有液氮預冷的冷凍小管中，放入液氮罐中保存一周以上。

1.2.3玻璃化法冷凍(NIV法)的復蘇從液氮中取出冷凍管，空氣中晃動10秒，將玻璃化的組織小滴或超細針上的組織塊由冷凍管里取出后，立即浸于37 ℃預熱的1 M sucrose液中放置5 min,使組織表面的玻璃化液完全溶解。再將組織于室溫下迅速移到0.5 M sucrose液中放置5 min, 接著在0.25 M sucrose液中5 min。最后, 解凍的卵巢組織在基礎液中漂洗3 次, 一起放入37 ℃培養箱孵育15～20分鐘, 進行下部分實驗。

1.2.4卵巢組織體外培養 卵巢組織體外培養液以α-MEM 為基礎液，添加 10% 人白蛋白, 1% ITS (10μg/ml 胰島素, 5.5μg/ml 轉鐵蛋白和6.7ng/ml 亞硒酸鈉), 0.3IU/ml 人卵泡刺激素 (Gonal-F), 50 μg/ml 維生素C, 0.47 mmol/L 丙酮酸， 2mmol/L L-谷氨酰胺 ， 75 IU/ml 青霉素和 75 μg/ml鏈霉素。

體外培養法采用Scott提出的培養方法，將新鮮或冷凍復蘇后各組的卵巢組織片切成約1 mm×1 mm×1 mm 大小，分組放入24孔培養皿中培養，每孔放4片組織塊。培養皿底部預先用100μl 細胞外基質包埋，使組織塊能更好在培養皿中生長。每孔中加入800 μl 新鮮培養液，培養皿放置在37℃培養箱中培養24小時。

1.2.5形態學分析(H&E染色)新鮮、冷凍復蘇后或經過短期體外培養后的卵巢組織經常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5μm連續切片，間隔10張進行蘇木素-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察始基卵泡的形態。為了避免重復計數，只有卵母細胞核深染的卵泡被計數在內。形態分析參照Gougeon提出的標準。

1.2.6免疫組織化學分析細織標本經常規處理、切片，脫蠟至水;微波抗原修復;體積分數 3 % H雙氧水阻斷內源性過氧化物酶; 一抗稀釋，4度孵育過夜; 二抗室溫孵育 30 min; DAB 顯色.蘇木素復染，二甲苯透明。已知陽性的組織作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗為陰性對照。微血管判定及 MVD 計數方法參照文獻[12]: 每張切片先在低倍(100 倍)視野鏡中選出血管最豐富的三個區域,然后在400 倍視野下由兩位經驗豐富的病理科醫師同時計數微血管3次, 取其平均值。凡被CD34免疫組化染色染成棕色單個內皮細胞或內皮細胞簇的,均作為一個血管計數,管腔結構形成并不作為判定的必要條件,已形成明顯肌層的血管不參與計數，由兩位經驗豐富的病理科醫師來進行微血管判斷。

1.2.7凋亡測定(TUNEL法檢測)新鮮或冷凍復蘇后的卵巢組織經常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，按5μm連續切片，間隔10張進行TUNEL染色。按照Promega DeadEndTM Fluorometric Tunel system檢測試劑盒說明書中步驟操作。

1.2.8異種移植至重度聯合免疫缺陷(SCID)小鼠采用8周齡雄性SCID小鼠，經培養的人卵巢組織異種異體移植至SCID小鼠腎包膜下或皮下，觀察移植短期(兩周后)卵巢組織細胞存活和新生血管情況 微血管評價：免疫組織化學或免疫熒光化學法檢測卵巢新生微血管。分析組織細胞凋亡情況：采用免疫組化和免疫熒光方法原位檢測組織CD31及表達，凋亡(TUNNEL)，并檢測凋亡相關因子。

1.3統計學方法采用chi-square 檢驗分析干預組和對照組移植后TUNEL陽性細胞百分率；采用方差分析比較干預組和對照組移植后微血管密度。其中P<0.05 被認為具有統計學意義，統計學軟件為SPSS 15.0。

2結果

將3例解凍卵巢組織(每例患者各8片組織，共24片組織)分為PDGF干預組與對照組(各12片)，添加干預組在常規培養液中添加了100ng/ml的PDGF，空白對照組按照常規培養，在體外培養 24小時后, 光鏡下觀察組織塊形狀干預組與空白對照組相比，組織塊向間質向外生長程度較好。在8周齡雌性SCID小鼠，分別將添加PDGF因子的干預組及未添加干預因子的空白對照組的人卵巢組織片各12片異體移植至SCID小鼠腹部皮下(每只小鼠腹部皮下移植2片，共移植12只老鼠。兩周后將組織片取出通過HE切片在光鏡下觀察移植卵巢組織形態學顯示卵巢組織存活良好(圖1)。對比PDGF干預組以及對照組的卵泡計數統計結果表明，PDGF干預組的卵巢組織中形態正常卵泡數目顯著高于對照組(P<0.05)。進一步通過免疫組織化學進行卵巢組織CD31染色檢測卵巢新生微血管情況(圖2)，結果表明添加PDGF因子培養后的卵巢組織移植物微血管密度顯著高于普通培養條件下的卵巢組織移植物(P<0.05)。

圖1PDGF組和對照組卵巢組織HE切片圖

Fig.1HE stain of ovarian fissue

注：(A) 添加PDGF干預組移植后兩周卵巢組織片HE染色情況，卵泡形態正常，結構緊密，與新鮮對照組相比間質較為疏松。(B) 對照新鮮卵巢組織片HE染色情況，卵泡形態正常，間質形態大致正常，間質較為疏松。(放大倍數400倍)。

圖2各組卵巢組織片免疫組化圖(CD31染色)

Fig.2Immunochistochemistry of Ovarian tissue

(A) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織片免疫組化染色CD31表達情況，CD31陽性表達的微血管密度較高。(B) 對照新鮮卵巢組織片免疫組化染色CD31表達情況，CD31陽性表達的微血管密度較低(放大倍數400倍)。

采用免疫熒光方法原位檢測組織凋亡(TUNEL)情況表明添加PDGF因子培養后的卵巢組織移植物凋亡細胞比例與對照組相比顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3PDGF組與對照組卵巢組織移植物的卵泡計數，微血管密度及凋亡比例

Fig.3Ovariantollicale, density of blood lessed and apoptosis

注：(A) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織片卵泡計數，PDGF干預組的卵巢組織中形態正常卵泡數目顯著高于對照組(P<0.05)。(B) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織片微血管密度，添加PDGF因子培養后的卵巢組織移植物微血管密度顯著高于普通培養條件下的卵巢組織移植物(P<0.05)。(C) 添加PDGF組移植后兩周卵巢組織中卵泡凋亡比例，添加PDGF因子培養后的卵巢組織移植物凋亡細胞比例與對照組相比顯著降低(P<0.05)。

3討論

惡性腫瘤是目前嚴重威脅人類生命的疾病，隨著醫療技術水平的進步，早期診斷和及時有效的治療，使惡性腫瘤患者的存活率得到極大改善。但大劑量放化療治療疾病的同時，也嚴重損害患者的性腺功能，腫瘤治愈后患者的生活質量越來越引起人們關注。在治愈疾病的同時應注重患者心理以及社會角色的恢復，對生殖健康的維護和生育能力的保存是生殖醫學、腫瘤學科，婦產學科等多學科共同探討的問題[2,13-15]。

隨著早期診斷和先進治療手段的發展，年輕的癌癥患者存活率大大增加。然而，細胞毒性的電離輻射和化療藥物可損害卵巢，常導致卵巢早衰造成內分泌及生殖功能損傷。為了改善這種困境，女性生育能力的保存是目前生殖醫學領域的研究的熱點，包括卵母細胞，胚胎和卵巢組織保存。其中，卵巢組織保存具有其獨特的優越性，因為它避免了超促排卵的潛在藥物副作用與時間的消耗。此外，卵巢組織保存保存不僅適用于育齡婦女，對于青春期前的女孩而言卵巢組織冷凍是目前唯一的生育力體外保存方法[16]。

凍融后卵巢組織內分泌功能的長期恢復一直是該領域研究的難點問題，凍融后卵巢組織卵泡發育和微循環重建可能與卵巢間質存活狀態有著千絲萬縷的關系。在卵泡發育過程中，卵巢間質具有支持、營養、促細胞增殖、遷移和穩定局部微環境的作用，部分細胞外基質可以結合生長因子，參與調控卵泡發育和血管新生過程。研究提示：凍融卵巢組織片移植后的 48小時內，由于早期的移植物缺血，新生血管尚未建立，缺血期和再灌注期低氧環境產生的氧代謝產物引起卵泡大量丟失。有學者回溯總結了卵巢移植的一些研究指出：冷凍后卵巢組織移植卵巢功能的恢復和維持不如新鮮卵巢組織移植。因此選擇合適的冷凍方案，合理的添加細胞外基質成分和抗氧化成分，在盡可能完好保存卵巢卵泡和間質的前提基礎上，建立卵巢移植模型，在移植前篩選增加干預因子降低缺血缺氧損傷，促進血管生長，維持微血管的功能，是卵巢組織冷凍保存和復蘇后重建卵巢功能的重要步驟。

卵巢組織成功的冷凍保存后，通過復蘇后卵巢移植完全恢復卵巢功能是一個理想狀態，但移植后卵巢功能重建仍是一技術難題。結合卵巢組織移植后的缺血損傷和新生血管的建立一直是卵巢冷凍移植的重點和難點問題，本課題提出玻璃化冷凍在保存卵巢間質細胞和血管基質成分具有優勢，一方面在冷凍技術上使多細胞盡可能完整保存，以利于組織微循環的再建，另一方面探討添加干預措施降低組織缺血和氧化應激損傷。本研究旨在改善凍融卵巢的生殖和內分泌功能恢復，通過短期培養過程中添加PDGF促進新生血管建立來改善卵巢移植后功能重建。異種移植模型中觀察到PDGF干預后卵巢組織微血管密度情況顯著增加。

由于形態學及超微結構分析在卵巢組織發育潛能評價中的局限性，我們通過對凋亡指標的分析比較不同冷凍方法在保存卵巢發育潛能方面的效果。細胞凋亡指細胞在一定的生理或病理條件下發生程序化死亡，細胞最后裂解成若干凋亡小體并被其他細胞所吞噬。各種環境刺激，包括溫度、創傷等均可誘導細胞凋亡的發生。在卵巢組織中，卵泡閉鎖、排卵、黃素化等過程都觀察到凋亡現象的發生，因此凋亡同人卵巢組織正常發育及其功能有密切關系。凋亡同形態學指標相比，在評判卵巢組織冷凍損傷方面更為敏感；同時凋亡的發生率可能反應了卵巢組織凍融后的發育潛能，因而是更有價值的反應卵巢功能的指標。通過TUNEL實驗中凋亡發生率的分析，我們發現PDGF干預組凍融卵巢組織經過短期培養與移植后凋亡比率顯著低于對照組，提示PDGF的添加可能通過改善卵巢組織微循環重建進而經過降低了卵巢組織的凋亡率。以上結果為優化卵巢組織體外培養以及移植物微循環重建效果提供了新思路，為臨床保存女性生育能力，建立人類卵巢組織庫提供了研究基礎。

4結論

我們首次在卵巢組織體外培養過程中短期添加PDGF促進卵巢血管生成。在異種移植模型中，我們發現添加PDGF因子的移植物微循環重建情況顯著改善，并且PDGF組移植物凋亡情況與對照組相比并凋亡顯著降低。以上結果為優化卵巢組織體外培養以及移植物微循環重建效果提供了新思路。

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The study of PDGF on reconstruction of microcirculation in transplanted frozen-thawed ovarian tissue in SCID mice

ZHANG Yaoyao，XIAO Zhun,WANG Yan,et al

(CenterofReproductiveMedicine,DepartmentofObstetricsandGynecology,WestChinaSecondUniversityHospital，SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Abstract】ObjectiveThe problems of the tissue injury and the reconstruction of microcirculation in frozen-thawed ovarian tissue after transplantation are still unsolved. This research aimed at improving the reconstruction of microcirculation in frozen-thawed ovarian tissue after transplantation. MethodsDuring the in vitro culture，PDGF was selected to regulate the angiogenesis and restore the injury of stroma in the short-term culture system before ovarian tissue transplantation, to reduce the hypoxia-ischemia and apoptosis, to promote the angiogenesis and maintain the vascular stability in ovary grafts. ResultsAfter short term culture, the ovarian tissues were transplanted into the SCID mice. After the addition of PDGF during in vitro culture， microvessel density count of ovarian tissue transplantation was significantly higher than control group.At the same time in situ immunofluorescence to detect the apoptosis situation (TUNEL) showed that in the group with addition of PDGF, the proportion of apoptotic cells was statistically significant lower compared with control group.ConclusionIn a xenograft model, we found that after addition of PDGF reconstruction of microcirculation ovarian graft is improved significantly, and the apoptosis of graft was significantly reduced. This study provided the research clue to optimize and improve the female fertility preservation system.

【Key words】Ovarian vitrification; Fertility preservation; Ovarian transptransplantation; Reconstruction of microcirculation; PDGF

基金項目：國家自然科學基金面上項目(C120205)

通訊作者：李尚為，教授，博士生導師，本刊編委，E-mail：lswivf01@sina.com

【中圖分類號】R 329.3

【文獻標志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.05.004

(收稿日期：2016-02-01； 編輯： 張文秀)