液相色譜質譜法測定乳品中動物水解蛋白的含量

侯文慧

摘 要：采用液相色譜質譜法測定乳品中動物水解蛋白的含量，樣品經牛蛋白酶酶解，乙腈萃取，HLB柱凈化，C18色譜柱分離，MRM模式，定量離子對（m/z）：132.1/86.2；定性離子對（m/z）：132.1/68.3。結果表明：回收率在92.18%～98.57%，相對標準偏差2.1%～4.8%；按信噪比RSN=3計算，定量限為2.5μg/kg。

關鍵詞：液相色譜-串聯質譜法；L-羥脯氨酸；乳品

中圖分類號 TS252.7 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）11-0134-02

Determination of L-Hydroxyproline in Dairy products by Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

Hou Wenhui

（Ulanqab Vocational College，Wulanchabu 012000，China）

Abstract：A method for determining the residues of L-Hydroxyproline in dairy products was established by an ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Samples was enzymatic digest of bovine，and ultrasonic extracted with ethyl acetate，and purified with HLB solid phase extraction cartridge，and separated by UPLC BEH C18 column，and quantitative analysis was performed by the multi-reaction-monitoring （ MRM） mode.The qualitative ion pair （m/z） was 132.1/86.2；the quantitative ion pair （m/z） was 132.1/68.3.The results show that the recoveries were between 92.18%～98.57%，and the relative standard deviation were between 2.1%～4.8%；According to RSN=3，the limit of quantificationn was 2.5μg/kg.

Key words：Liquid chromatography tandem mass spectrometry；L-Hydroxyproline；Dairy products

乳品中摻入動物水解蛋白是提高其蛋白質含量的主要摻假手段，而動物水解蛋白是由動物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質，長期誤食，可導致關節疏松、腫大，造成重金屬中毒。衛生部《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第二批）》中明確要求：乳及乳制品、含乳飲料中不得添加水解動物蛋白。動物水解蛋白中特征性氨基酸是L-羥脯氨酸，而乳蛋白質中不含L-羥脯氨酸。為此，L-羥脯氨酸已作為檢測乳及乳制品中是否非法摻入動物水解蛋白的重要標示物。

目前，針對動物水解蛋白的測定方法有分光光度法[1]、液相色譜法[2-3]等，而關于超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）測定乳品中動物水解蛋白含量的研究較少。為此，本文以乳品為研究對象，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法測定乳品中動物水解蛋白含量的分析方法，為其檢驗檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-串聯四極桿質譜儀（Waters Acquity UPLC Quattro Premier XE，美國沃特世公司）；電子分析天平（XS-205型，賽多利斯北京有限公司）、超純水器（Milli-Q型，美國Millipore公司）。L-羥脯氨酸標準品（CAS號：51-35-4），純度≥99.5%，購自上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈、甲醇、正己烷（色譜純，德國默克公司）。所用試劑除特別標注外均為分析純試劑，水為超純水。

1.2 儀器工作條件 色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×150mm，1.7μm）色譜柱；柱溫：30℃；流動相：乙腈-0.1%甲酸水（體積比10：90）；流速：0.2mL/min。質譜條件：電噴霧電離，ESI（+）；監測方式：MRM；源溫度：150℃；脫溶劑氣：氮氣，600L/Hr，350℃；錐孔氣：氮氣，45L/Hr；碰撞氣：氬氣；噴霧電壓：2.5kv；定性離子對（m/z）：132.1/68.3；定量離子對（m/z）：132.1/86.2；錐孔電壓：20V；碰撞電壓：25V。

1.3 樣品前處理 精確稱取試樣2g置于50mL塑料離心管中，加入100mmol/L甲酸銨溶液5mL和牛蛋白酶液50μL，渦旋2min，50℃酶解3h，加入5mL乙腈，振蕩2min，10 000r/min 離心10min，上清液用HLB小柱凈化，待自然流干后，用0.1%甲酸-乙腈4mL清洗上述離心管，并將清洗液依次過柱，收集全部流出液體，35℃水浴氮氣吹至近干，準溶解定容后過濾，供LC-MS分析。

1.4 標準曲線繪制 取空白基質試樣6份，分別加入適量的標準工作溶液，制備成含L-羥脯氨酸濃度依次為5μg、10μg、20μg、50μg、100μg/kg，按1.2節和1.3節操作，以特征離子色譜峰面積為縱坐標，L-羥脯氨酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程。

2 結果與分析

2.1 質譜條件優化 L-羥脯氨酸是弱酸性化合物，故采用正離子模式掃描。將L-羥脯氨酸標液注入質譜檢測器，進行一級質譜掃描，得到m/z為132.1的準分子離子峰[M+H]+，優化錐孔電壓等參數使分子離子峰達到最大強度；對分子離子峰進行碰撞碎裂優化，選擇MRM模式，離子源溫度為150℃，碰撞氣為氬氣，錐孔電壓為30V，碰撞電壓為30V，進行子離子掃描分析，得到其碎片離子（圖1），定量離子對（m/z）132.1/86.2；定性離子對（m/z）132.1/68.3。在上述質譜條件下，LC-MS總離子流圖中，L-羥脯氨酸色譜圖峰型對稱尖銳，峰型良好，無明顯的干擾峰（圖2）。

3 結論

動物水解蛋白是由動物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質，長期誤食，可導致關節疏松、腫大，造成重金屬中毒，目前L-羥脯氨酸已作為檢測乳及乳制品中是否非法摻入動物水解蛋白的重要標示物。本文建立了液相色譜質譜法測定乳品中動物水解蛋白的含量，該法準確度高、靈敏度好，可為乳品檢驗檢測提供實際的檢測技術參考。

參考文獻

[1]趙天珍，袁秀金，譚貴良，等.比色法快速測定奶粉和含乳飲料中游離L-羥脯氨酸[J].食品研究與開發，2008，29（12）：111-113.

[2]李景紅，孟祥晨.高效液相色譜法檢測牛乳中摻加的膠原水解蛋白[J].中國乳品工業，2008，36（11）：56-59.

[3]胡華，呂定，杜青，等.高效液相色譜法檢測醬油中羥脯氨酸的含量[J].中國調味品，2010，35（4）：106-109. （責編：張宏民）