MiR200對(duì)腎癌細(xì)胞纖維化影響的相關(guān)性分析

施瑩，林玲，闞佳音，劉海燕，馬增偉，李雙宇.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾　6000；.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院微形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，黑龍江齊齊哈爾　6000

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MiR200對(duì)腎癌細(xì)胞纖維化影響的相關(guān)性分析

施瑩1，林玲1，闞佳音1，劉海燕2，馬增偉1，李雙宇1
1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院病理學(xué)院微形態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，黑龍江齊齊哈爾161000

［摘要］目的研究MiR200對(duì)腎癌細(xì)胞纖維化的影響機(jī)制，為鑒定治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。方法整群選取2013年1月—2015年1月該院收治的51例腎癌患者病例資料，于實(shí)驗(yàn)室，建立腎癌細(xì)胞株模型，采用癌旁正常組織作為對(duì)照，應(yīng)用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和Westermblot法檢測(cè)靶基因蛋白表達(dá)方法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果MiR-200組在SN12-PM6和786-0平均穿膜細(xì)胞的個(gè)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MiR-200組ZEB1蛋白表達(dá)下降，而在E-cadberin蛋白表達(dá)上升，經(jīng)相關(guān)系數(shù)比較，MiR-200的表達(dá)與E-cadberin成正相關(guān)（r=0.824）而ZEB1成負(fù)相關(guān)（r=-0.762）。結(jié)論MiR-200能夠調(diào)節(jié)皮脂纖維化的侵襲，降低ZEB1蛋白表達(dá)，從而E-cadberin蛋白表達(dá)上升。

［關(guān)鍵詞］MiR200；腎癌細(xì)胞；ZEB1；E-cadberin

隨著人類基因組學(xué)的不斷發(fā)展和重視，微小RNA已經(jīng)越來(lái)越受到人們的重視，其功能和控制人類基因至少三分之一編碼蛋白基因的表達(dá)。MicroRNA（miRNA）則是由長(zhǎng)度19～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA［1］。該研究于2013年1月—2015年1月整群選取入住該院腎癌患者51例病理資料為研究對(duì)象，就miRNA在腫瘤纖維化中發(fā)揮的作用的相關(guān)性進(jìn)行研究，為腎癌的發(fā)展提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

整群選取于2013年1月—2015年1月該院腎癌住院患者51例病理資料為研究對(duì)象，其中男性28例，女性23例，年齡43～78歲，平均年齡（62.63±4.89）歲，其中，中早期患者（局部進(jìn)展性）39例，晚期患者（轉(zhuǎn)移型腎癌）12例。所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為腎癌患者［3］，并未合并糖尿病等其他臟器功能障礙患者。并取得患者知情同意，經(jīng)該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)此項(xiàng)研究。

1.2細(xì)胞株

該研究選取腎癌組織和癌旁正常組織均來(lái)自該院腎臟外科手術(shù)切除樣本。選取其癌細(xì)胞株786-O和 A498。腎癌細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基采用1％青-鏈霉素和10％胎牛血清構(gòu)成，至于37℃中5％CO2和相對(duì)濕度90％環(huán)境下培養(yǎng)箱中保存，保障良好的細(xì)胞貼壁狀態(tài)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的情況進(jìn)行2～4 d傳代一次。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（1）包被基底膜：該研究采用培養(yǎng)液和50 mg/L Matrigel按體積8：1進(jìn)行稀釋配置，包被位于Transwell小室的室面上，采用4℃進(jìn)行風(fēng)干。（2）水化基底膜：在小室中吸出殘余的液體，以孔為單位，每孔加入50 uL具有10 g/L BSA的無(wú)血清培養(yǎng)液。保持溫度為37℃，持續(xù)時(shí)間為30 min。待細(xì)胞脫離血清處于饑餓狀態(tài)12～24 h后在制備細(xì)胞懸液。（3）胰酶消化細(xì)胞，在消化終止后離心，去掉培養(yǎng)液，采用PBS進(jìn)行洗滌，2次，再次使用BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，使之重懸，使細(xì)胞濃度控制在1×105/mL。取細(xì)胞懸液100 uL，加入Transwell小室中，在24孔板下室加入由10％胎牛血清構(gòu)成的培養(yǎng)液500 uL，培養(yǎng)24 h。（4）細(xì)胞計(jì)數(shù)：先用棉簽擦凈上室內(nèi)的細(xì)胞，采用0.1％的結(jié)晶紫染色，通過(guò)顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)其平均數(shù)。

1.3.2Westermblot法檢測(cè)靶基因蛋白表達(dá)（1）抗體：該研究抗體由Rabbbit polyclonal ZEB1、Rabbbit polyclonal E -cadherin、Rabbbit polyclonal β-Actin和Horseradish peroxidase -conjugate secondary goat anti -rabbit組成。（2）配置1XTris-甘氨酸電泳緩沖液，由18.8 g甘氨酸，3.03 g Tris，1 g SDS構(gòu)成，使之蒸餾水溶解，配置成1 000 mL保存；配置轉(zhuǎn)膜緩沖液，由2.9 g甘氨酸，5.8 g Tris，在使用前添加200 mL甲醇，依然配置1 000 mL，配置10XTBS緩沖液，由24.2 g Tris，80 gNa-Cl，配置1 000 mL，和1XTBS緩沖液，1XTBS緩沖液由10XTBS緩沖液稀釋得到，所有緩沖液均室溫保存。（3）采用6孔板進(jìn)行細(xì)胞蛋白樣品提取，每孔加入含有蛋白酶抑制劑和PMSF的蛋白裂解液150 uL，在冰上進(jìn)行，上搖床震蕩20 min，刮下細(xì)胞，放置在1.5 mLEP中，然后進(jìn)行超聲處理，在4℃環(huán)境下離心12 000 rpm，5 min后進(jìn)行分裝至于-80℃保存。（4）BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度：該操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。然后經(jīng)免疫反應(yīng)和ECL化學(xué)發(fā)光和凝膠圖像儀進(jìn)行分析結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行錄入、分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)推斷，計(jì)數(shù)資料采用（n，％）表示，組間比較采用Χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MiR-200抑制腎癌細(xì)胞侵襲能力分析

該結(jié)果通過(guò)Matrigel凝膠測(cè)量，觀察兩組24 h細(xì)胞穿透該凝膠的能力判斷抑制癌細(xì)胞侵襲能力。MiR-200組在SN12-PM6和786-0平均穿膜細(xì)胞的個(gè)數(shù)分別為42和35，經(jīng)Χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均小于對(duì)照組，說(shuō)明通過(guò)拮抗MiR-200可顯著抑制腎癌細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)表1。

表1　兩組細(xì)胞侵襲能力比較

2.2MiR-200調(diào)控ZEB1和E-cadberin表達(dá)情況比較

根據(jù)Wwsternblot結(jié)果顯示，MiR-200組ZEB1蛋白表達(dá)下降，而在E-cadberin蛋白表達(dá)上升，詳見(jiàn)表2。經(jīng)相關(guān)系數(shù)比較，MiR-200的表達(dá)與E-cadberin成正相關(guān)（r=0.824）而ZEB1成負(fù)相關(guān)（r=-0.762）。

表2　MiR-200調(diào)控各指標(biāo)表達(dá)情況（Relative levels of miRNA）

3　討論

臨床資料顯示［4］，20％～30％在患有腎癌時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，直接導(dǎo)致治療效果不佳，直接影響患者生存質(zhì)量。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是導(dǎo)致了轉(zhuǎn)移的重要依據(jù)，它是通過(guò)上皮細(xì)胞特定的形態(tài)學(xué)增生繁殖的過(guò)程，加快了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，通過(guò)組織重建的生理現(xiàn)象，直接導(dǎo)致了組織纖維化的病理過(guò)程，從而進(jìn)一步加速了腫瘤的侵襲。Honeyman研究表明［6］，E-鈣黏蛋白（E-cadberin）是細(xì)胞間的粘附分子，對(duì)細(xì)胞間的連接，阻止細(xì)胞侵襲起到了至關(guān)重要的作用，它的表達(dá)水平下降直接導(dǎo)致粘附能力下降，使細(xì)胞間連接受到阻礙，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的侵襲。這與該研究得到結(jié)論一致。該研究也為證實(shí)E-cadberin在腎癌細(xì)胞中也有表達(dá)，表達(dá)量分別為0.99和1.07，得到了一致的結(jié)果。該研究顯示，MiR-200在腎癌中也是通過(guò)ZEB1起到了EMT作用，從而促使其癌細(xì)胞的侵襲，通過(guò)檢測(cè)，MiR-200組ZEB1蛋白表達(dá)下降，而在E-cadberin蛋白表達(dá)上升，并且在相關(guān)性檢驗(yàn)中，MiR-200的表達(dá)與E-cadberin成正相關(guān)而與ZEB1成負(fù)相關(guān)（r=-0.762），說(shuō)明MiR-200可以抑制ZEB1的表達(dá)從而提高E-cadberin的表達(dá)，MiR-200的含量越低E-cadberin的含量也越低，細(xì)胞的侵襲能力也越強(qiáng)。這些結(jié)果都和相關(guān)其他研究得到了類似的研究結(jié)果，目前研究中，都證實(shí)MiR-200與E-cadberin表達(dá)具有關(guān)聯(lián)，其研究計(jì)算相關(guān)系數(shù)為r= 0.736，該研究根據(jù)數(shù)據(jù)得知其具有正相關(guān)關(guān)系（r= 0.824），而存在于中間變量即為ZEB1的表達(dá)，ZEB1的表達(dá)在這中間起到了橋梁的作用，這些都有助于鑒定未來(lái)有意義的治療靶向，為抑制腎癌轉(zhuǎn)移提供科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，隨著對(duì)microRNA的研究機(jī)制越來(lái)越系統(tǒng)化和科學(xué)化，人們對(duì)其的認(rèn)識(shí)也會(huì)越來(lái)越多，目前很多學(xué)者正在研究使用藥物抑制腫瘤增生纖維化，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，而miRNA在腫瘤中扮演著重要的作用，因此如何在MiR-200在腫瘤中低表達(dá)的水平得到補(bǔ)充，補(bǔ)充的MiR-200是否也可以抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，需要進(jìn)一步的體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)才能證實(shí)，該研究立足于腎癌機(jī)制研究，將有助于了解腎癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程，為未來(lái)研究提供了理論基礎(chǔ)。

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Correlation Analysis of Effect of MiR200 on Renal Carcinoma Cell Fibrosis

SHI Ying1，LIN Ling1，KAN Jia-yin1，LIU Hai-yan2，MA Zeng-wei1，LI Shuang-yu1
1.Department of Nephrology，Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang Province，161000 China；2.Micro Morphology Experimental Center，Institute of Pathology of Qiqihar Medical School，Qiqihar，Heilongjiang Province，161000 China

［Abstract］Objective To research the effect mechanism of MiR200 on renal carcinoma cell fibrosis and provide theoretical basis for identification and treatment of target. Methods The data of 51 cases of patients with renal carcinoma treated in the central laboratory of Qiqihar medical school were selected，the renal cell carcinoma strain model was built，the adjacent normal tissue was used for contrast，the target gene and protein expression was detected by cell invasiveness experiment and Westermblot method，and the correlation between the invasion ability of renal carcinoma cell of MiR-200 and ZEB1，E-cadberin and MiR-200 was analyzed. Results The difference in the average penetrating cell number of SN12-PM6 and 786-0 in the MiR-200 group had statistical significance，P＜0.05，the ZEB1 protein expression in the MiR-200 group decreased，but the E-cadberin protein expression in the MiR-200 group increased，and the correlation coefficient comparison showed that the miR-200 expression was positively correlated with E-cadberin，（r=0.824）but was negatively correlated with ZEB1，（r=-0.762）. Conclusion MiR-200 can adjust the invasion of sebum fibrosis and reduce the ZEB1 protein expression thus increasing the E-cadberin protein expression.

［Key words］MiR200；Renal carcinoma cell；ZEB1；E-cadberin

［中圖分類號(hào)］R737.11

［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1674-0742（2016）05（b）-0084-02

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.14.084

［基金項(xiàng)目］齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目任務(wù)（FSGG201422）。

［作者簡(jiǎn)介］施瑩（1975.6-），女，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：腎臟疾病。

收稿日期：（2016-02-17）