轉基因成分檢測抽制樣方法在農業生物安全風險監測方面的應用

楊曉懷++李永紅++張森泉++汪洪忠++陳紅娜++周志豪

摘 要：通過抽樣檢測判斷農作物、農產品是否含有轉基因成分，實現從本土種植地的田間作物及農產品終端開展檢測進行追溯，從而掌握農業轉基因生物安全狀況。該文系統地闡述了農業轉基因生物安全風險監測的必要性、監測范圍和方法、樣品制備、檢測方法分析、田間作物抽樣檢測、風險檢測處置等。通過科學應用田間作物及農產品轉基因成分抽制樣方法，實現農業轉基因生物安全風險監測的規范有效。

關鍵詞：生物育種；風險監測；抽制樣；誤差控制

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）11-0028-06

Application of Specimen Preparation Method for Detection of Transgenic Component in Agriculture Bio-security Surveiuance

Yang Xiaohuai et al.

（Shenzhen Agricultural Science and Technology Promotion Center，Shenzhen 518000，China）

Abstract：In genetically modified organisms risk monitoring， through sampling， whether crops， agricultural products contain genetically modified ingredients from local gardens field crops and agricultural terminals to carry out the trace detection， so as to grasp the agricultural genetically modified organisms safety conditions. Risk of genetically modified （gm） detection in addition to the following general sampling theory， should consider about the sampling of the test method of detection limit and the legal tolerance of the samples of genetically modified ingredients. Through scientific application of field crops and agricultural transgenic component specimen preparation method， realizes the agricultural genetically modified organisms safety risk monitoring specification is effective.

Key words：Biological breeding； Risk monitoring；Specimen preparation； Error control

1 農業轉基因生物安全風險監測必要性

世界人口持續增長、資源短缺、生態環境惡化等因素嚴重威脅著糧食生產的可持續發展。轉基因生物育種技術打破了不同物種間的界限，能夠有目的地、快速地將不同物種間的優良性狀集中到一個品種上，拓寬作物遺傳改良可資利用的基因來源，縮短育種周期[1]。因此，將傳統作物育種技術（改良種質）、新型轉基因技術（獲得新型性狀）、分子標記輔助選擇育種（加速育種進程）相結合，將是增加世界糧食產量最有希望的技術戰略。我國在農作物常規育種方面有較好基礎，但單純依靠常規技術已無法突破當前農業生產的技術瓶頸，唯有實現常規育種與生物技術的結合才能實現傳統產業升級和跨越式發展，滿足當前高產、優質、抗逆、抗病蟲新品種培育的需要。生物技術的進一步開發應用還能促進傳統農業向醫藥、化工、能源、環保等領域的拓展，在緩解資源約束、實現農業增長方式的轉變中發揮更大的作用。因此，推進現代種業生物技術的研究、應用與產業化，是著眼于我國現實和未來農業發展的重大戰略，是確保國家糧食安全的必然選擇。

目前，我國在發展轉基因生物技術上采取的是“研究上大膽，推廣上慎重”的基本策略，根據我國轉基因生物安全管理條例等法律法規，未經批準的轉基因產品禁止進口或流入市場，以防污染種子、生物鏈和食物鏈；我國要求對轉基因產品實施從田間到餐桌全程管理，已批準的轉基因產品需要按規定標識。概括地說，轉基因作物監管主要包括播種前的種子監管，播種后的田間監管，以及口岸、加工企業和貿易市場的監管。

開展轉基因生物風險監測，通過抽樣檢測判斷農作物、農產品是否含有轉基因成分：一方面，是從本土種植地的田間作物開展監測，另一方面，因市場交易的復雜性，從農產品終端開展檢測進行追溯，可掌握轉基因農產品食用安全狀況。目前深圳市監測手段通常采取實驗室PCR定性方法檢測、田間作物試紙條快速檢測方法等為主。自2002年起，我市開展轉基因生物安全風險評估，系統和持續地對田間作物及農產品開展例行監測、普查、潛在風險分析、建立風險監測數據庫等，并將田間作物及農產品轉基因成分抽制樣方法應用在全市農業轉基因生物安全風險監測方面。

2 深圳市現代生物育種技術應用狀況

深圳是國外轉基因產品入境的重要口岸，又是國內相關產品出口的重要通道，所涉作物品種多、數量大。據海關初步統計，近年來每年從美國、巴西、阿根廷等國進口大豆、玉米、油菜籽等約300萬t，其中85%是轉基因產品，從事糧油加工的大型企業每年使用來自巴西、阿根廷、美國等的轉基因大豆約180萬t，所生產的品牌食用油產品不僅占據了深圳的糧油市場，在全國也占有一定的市場份額，而且有部分出口到港澳等地。深圳又是我國重要的生物高科技戰略基地，一些國內知名的育種研發基地也相繼落戶深圳。截至2015年末，深圳市轄區內從事進口轉基因大豆、油菜籽等粗、深加工的大型企業十多家，此外，深圳還有為數較多從事相關技術研發、產品生產及經營的企業、科研院所。隨著農業轉基因生物技術發展及其產品商業化進程加快，被批準實施的試驗項目和進入商業化應用的生物品種將逐步增加，提高了我市對轉基因生物環境釋放、生產性試驗的風險評估要求，也催生了我市開展農業轉基因生物安全風險監測的需求。

3 風險監測范圍及方法

3.1 監測品種及范圍 根據農業轉基因生物安全監管需要，深圳在全市范圍開展專項風險監測。監測范圍覆蓋農業轉基因生物研發單位，種子生產經營單位，進口轉基因生物加工企業，糧油專業市場和集散地、農產品批發市場、超市等。根據當前轉基因作物生產應用現狀及目前檢測機構承檢范圍，我市具備轉基因成分檢測資質的檢測機構包括：農業部農作物種子質量監督檢驗測試中心（深圳）、深圳市計量質量檢測研究院、深圳市通量檢測科技有限公司、深圳市華測檢測技術股份有限公司等。

目前，列入我國第一批實施標識管理的農業轉基因生物目錄主要有5大類作物17種產品，而結合當前世界轉基因生物技術應用發展實際及我市區域作物種植特點、市場交易產品范圍等因素，本區域監測的農作物品種更為廣泛，主要包括：水稻、玉米、油菜、大豆、辣椒、番茄、番木瓜、馬鈴薯等8大類作物品種，具體監測對象包括：水稻種子、大米及米制品；玉米種子、玉米及其制品；大豆及其制品；番木瓜；辣椒；番茄；油菜；以玉米或水稻為主要原料的飼料等（表1）。

3.2 檢測方法分類 當前，轉基因檢測方法根據檢測對象劃分大致可分為4類：生物體水平、DNA水平、mRNA水平和蛋白質水平。

3.2.1 生物體水平 即蟲測法，以轉基因作物的器官飼喂害蟲，觀察害蟲的死亡率[2]、發育狀況等。此法條件高，檢測能力有限，占用空間大，所需時間長，但最為直觀。

3.2.2 mRNA水平 在轉錄水平檢測外源基因的表達情況，主要采用Northern雜交。即用已知序列的DNA或RNA標記探針與mRNA序列互補成雜交雙鏈，通過探針標印記即可檢出雜交體。

3.2.3 蛋白質水平 在翻譯水平檢測外源基因的表達情況，主要方法有酶聯免疫吸附分析法（ELISA）、雙向電泳、Western雜交、層析及免疫印跡等。近年來農業部推行快速試紙條檢測方法，即是應用免疫層析原理，在樣品溶解獲取蛋白后，樣品溶液中的特定蛋白與標記的抗體發生抗原-抗體的特異性的結合作用，流經檢測帶時抗原-抗體復合物被固定在檢測帶上的捕獲抗體結合，聚集形成肉眼可見的條帶，顯示陽/陰檢測結果。目前，試紙條可適用于大豆、玉米、棉花、油菜、苜蓿等農作物中轉基因成分的快速定性檢測。采用免疫層析法快速檢測樣品中轉基因蛋白，整個過程只需5～10min。檢測靈敏度可達0.1%，而且具有成本低、檢測方法快速簡單的優點。因不同作物類型樣品成分組成差異巨大，葉片中的葉綠素、稻谷中的多酚、玉米糊中的淀粉等都會對檢測結果造成影響，且不同試紙的靈敏度和特異性有所不同，容易導致假陽性、假陰性和流動不暢等各種問題，還受檢測靶標種類少等局限，目前較適用于部分田間作物的葉片檢測，且經篩選出來的陽性葉片樣品需進一步進行實驗室PCR定性檢測確認。

3.2.4 DNA水平 檢測轉基因作物基因組中是否含有外源基因。常用方法有定性定量PCR、DNA測序、Southern雜交以及基因芯片技術等。目前，實驗室檢測較為常用的為實時熒光定量PCR （Quantitative Real-time PCR），全稱“聚合酶鏈反應技術”，是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法[3]，通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。定性PCR轉基因食品重組DNA的基本結構包括啟動子、目的基因、終止子和標記基因。由于目的基因種類繁多，所以先用轉基因食品最常用的轉錄啟動子CaMV35S、轉錄終止子NOS及抗生素抗體基因NPTII3個序列來設計引物進行PCR反應，對結果陽性者可再檢測目的基因。在轉基因成分檢測中，PCR技術存在檢測成本較高、耗時較長的問題，但由于具有檢測范圍廣、靈敏度高、自動化程度高等優點，僅需微量的DNA就可以同時檢測多個樣品，在轉基因成分檢測中應用較廣。

4 風險監測的樣品制備

4.1 確定樣品制備原則 在滿足檢驗最低抽檢量要求、待測樣品能代表總體抽樣對象特征為基本前提下，滿足以下原則：

4.1.1 動態化 根據轉基因農產品質量安全風險，分析隱患分布及變化情況，及時調整監測品種、監測區域、監測參數和監測頻率。

4.1.2 防污染 轉基因成分檢測以遺傳物質DNA為模板，需重點避免樣品受到外部污染、交叉污染和損失。制備技術和裝置在樣品制備過程中不破壞樣品代表性，不改變樣品組成。

4.1.3 同概率 原始樣品的各部分以相同的概率進入最終樣品，保證樣品具有代表性。

4.1.4 合理性 應根據待測特性、原始樣品的量及粒度以及待采樣抽樣對象的性質，如：植株、鮮農產品、加工品、液體等不同情況，確定樣品制備的步驟及應采用的技術。

4.1.5 規范性 針對不同作物（如玉米、油菜）、樣品形態（種子、粉末和油）、檢測方法確定抽樣方法及樣品大小，引用通性規則（靜批抽樣與動批抽樣，均勻批與不勻批抽樣）。

4.2 樣品制備流程 轉基因檢測樣品抽樣包括以下環節：采樣前分析、實驗室樣品制備、樣品信息采集、樣品保存及檢測等，因此，抽樣標準必須規范以上各個環節。

4.2.1 采樣前數據分析 采樣前，根據轉基因生物安全風險輿情分析數據，確定抽樣目標，調查抽樣對象的來源、種類、批次、生產日期、總量、包裝堆積形式、運輸情況、貯存條件、貯存時間、所監測品種可能存在的成分逸散和污染情況，以及其他影響抽樣對象發生變化的材料。

4.2.2 取樣分類 按照不同樣品類型，采取不同的樣品制備方法（采樣、保存），根據轉基因生物安全監測目標，通行的檢測樣品一般分為三類：（1）原始材料：種子、植株、水果等；（2）初級加工品：大豆豆粕、米粉或豆粉、動物飼料等；（3）深度加工品：植物油、番茄醬等。但是，深加工產品外源基因片段降解、食用添加劑、其他原材料混雜等因素干擾，提高了檢測難度，也相對影響了檢測結果的準確性。

4.2.3 實驗室樣品制備 采樣時，選擇不與樣品發生化學反應的材料制成的采樣器，如果采樣時間較長，中間樣品用密封容器保存，盛樣容器要依據被檢抽樣對象的性質而定。

4.2.4 樣品信息采集 采樣后，要及時記錄樣品名稱、規格型號、批號、等級、產地、采樣基數、采樣部位、采樣人、采樣地點、日期、天氣、生產廠家名稱及詳細通訊地址等內容。

4.2.5 樣品保存 樣品量應滿足檢測及備查的需要，把樣品等量分成2份，1份供檢測用，1份留作備查。每份樣品量至少應為檢驗需要量的3倍。保存：（1）惰性的包裝材質，合適的包裝形式，貼上有規定內容的標簽，樣品制成后應盡快檢驗。（2）備檢樣品一般貯存在低溫低濕的環境下，水分含量較大的番茄、圓椒等樣品可在-20℃保存90d，如需延長保存，則需在-80℃環境，以保證蛋白質分子和DNA的完整性；油菜、玉米等種子，大豆粉、玉米油等干燥密封的樣品，則可以在4℃環境下保存。根據特殊需要和樣品特性，可以適當延長和縮短。

4.2.6 樣品檢測 根據特定檢測目的，結合檢測的時效要求，確定檢測手段，如：實時熒光定量PCR、快速試紙條監測方法等，并對檢測結果進行分析與處理，實現監測目標。

5 PCR檢測的抽制樣方法分析

5.1 抽制樣檢測原理 轉基因風險檢測的抽樣除遵循一般的抽樣理論以外，還必須考慮以下幾方面：（1）轉基因成分檢測以DNA遺傳物質為模板，樣品制備以生物最小遺傳單位為基礎，與種子顆粒大小密切相關；（2）樣品大小需根據轉基因檢測極限、二項分布和最小顆粒重等綜合計算；（3）轉基因成分檢測靈敏度高，經PCR擴增，能將目的基因或某一DNA片段在數小時內擴增至上萬倍，即能在100萬個細胞中檢出1個靶細胞。為此，防止樣品污染乃重中之重，取樣器材在不同批次樣品的抽取過程中要注意清洗；貯存樣品的容器或包裝要一次性使用或溶劑反復清洗；（4）遵循檢測極限原理，樣本容量不小于檢測極限要求；（5）考慮國家轉基因標識的閾值和法律規定，樣本容量不小于閾值要求的最低樣本量。

所謂檢測極限，是指檢測方法能夠準確識別的最低含量。目前的定性PCR方法檢測極限一般在0.1%左右。也就是說，1 000粒種子中有一粒轉基因種子就可以準確檢測出來，低于這個含量將不準確。同時，PCR反應體系中，至少要有一個以上轉基因DNA分子拷貝，才有可能得到陽性結果，這是理論檢測極限。

不同的檢測方法檢測極限不同，抽樣必須滿足檢測方法的極限要求。定性PCR檢測極限一般為0.1%左右，而定量PCR極限一般為反應體系中有20個基因組拷貝（百分含量需要根據不同物種的基因組大小進行換算）。

目前，我國采取較為嚴格的定性標識制度，只要轉基因檢測技術能夠檢測到轉基因成分，就認為是轉基因產品。歐洲、日本等國家采取定量標識制度，樣品中轉基因成分含量高于規定閾值則需要標識為轉基因。歐盟國家的轉基因標識閾值[4]是0.9%，巴西、澳大利亞等的是1%，日本加拿大等的是5%。閾值越低，檢測的樣本量要求越高。

5.2 抽制樣誤差控制 在轉基因產品成分檢測過程中，抽樣關系到檢測結果的準確性和可靠性，涉及到較復雜的統計學和分子生物學原理。檢測結果是樣品的特性反映，而樣品能否代表總體的實際情況將取決于抽樣的效果。抽樣必須要有代表性，抽樣量在抽樣成本控制等條件下，必須足夠大，以便含量低的成分也能被檢測到。因此，一個科學的抽樣方案必須考慮如何獲得有代表性的樣本以及抽多少樣的問題。抽樣方案還必須針對具體情況，解決具體問題（如種子、大田抽樣問題等）。

5.3 抽制樣標本量 在確定實驗室樣品大小時，將定性檢測和定量檢測分開考慮（檢測極限不同）；將均勻批和不均勻批要分開考慮（抽樣誤差不同）。

5.3.1 定性檢測 從樣品總體中只要檢出至少包括一粒陽性種子（成分），即定義為陽性樣品。由于PCR定性檢測的極限值（LOD）為0.1% [5]，因此，分析樣品1 000粒種子中有1粒是陽性是最低條件。

根據以上分析，進行轉基因種子的定性檢測（在通用檢測極限0.1%假定下），置信度為95%時，最低樣本量為3 000粒種子；置信度為99%時，則至少5 000粒左右。即：磨樣3 000粒種子，檢測100次可得到95次正確結果；磨樣5 000粒種子，檢測100次可得到99次正確結果。

最低抽樣量可以用種子粒數表示，在實際操作應用中，為方便取樣，一般最低取樣量以重量為單位，便于稱量（表3）。

如果不是種子，而是粉狀物或液體等，則以經驗LOD≥20個拷貝為原則。為了應用方便，通常以基本顆粒數不少于10 000為計數基礎。根據《NY/T 673-2003 轉基因植物及其產品檢測 抽樣》規定，一般情況下，按照表4確定送檢樣品的最小量。特殊情況下，可適當增減。

6 田間作物轉基因成分抽樣檢測

轉基因作物是應用生物技術對農作物基因組進行改造獲得的。雖然我國對轉基因農作物商業化種植持謹慎的態度，但全國乃至全球的轉基因作物種植面積仍然快速增加，推廣的轉基因品系不斷增多。隨著對轉基因產品進行風險評估及相關法規相繼出臺，田間作物的轉基因成分風險監測和檢測鑒定顯得越來越重要。目前，常用快速試紙條檢測方法對葉片進行初步篩選檢測，再用實驗室PCR檢測法進行二次確認。

6.1 確定本土作物生長周期 與農產品監測的隨機性不同，田間作物監測需根據田間作物種植區域性特點，結合本土作物的生長周期，確定監測時間，以保證監測及時性、有效性和針對性。一是在播種前開展種子轉基因成分檢測，二是在作物開花期前開展田間作物葉片抽樣，及時防范違規種植的轉基因作物通過種子、花粉等傳播途徑擴散外源基因、造成環境污染。作物抽樣時間規律如下：

水稻：喜溫怕寒，適宜在廣東省種植。我市水稻一年兩熟，分為早造、晚造。早造生育期一般為120～130d，3月下旬開始種植，清明前后插秧；晚造生育期一般為150～160d以上，7月下旬開始播種，12月中旬收割。

玉米：四季均可種植，春玉米的主要生育期為3-6月，冬種玉米播種期為11月上旬（晚稻收割后），次年3月中旬成熟。

油菜：廣東省油菜種植規模較小，主要以冬油菜為主，生育期一般為130～290d，播種期為10月下旬或11月上旬。

辣椒：在我市一年四季均可種植，但春夏季節雨量較多，容易傳染病害，加之為避開臺風，宜秋冬季種植。

番茄：在我市一年四季均可種植，播種一般為8-9月，9-10月份移栽，11月中旬開始采收。

6.2 田間作物風險監測的樣品制備方法

6.2.1 確定取樣地點選擇 按照通用原則，針對種植同一作物品種的，1.33hm2以下的大田采用5點法，選取具有代表性的5個單位調查取樣 [6]；1.33hm2以上的大田，按每0.267hm2左右作為一個調查取樣單位，確定該大田作物的調查取樣單位總量。

田間作物一般片塊分布較均勻，目前較通用的是采取點狀取樣法，即從田塊四角的2條對角線的交駐點（田塊正中央），以及交駐點到4個角的中間點等5點取樣；或者，在離田塊四邊4～10步遠的各處，隨機選擇5個點取樣。

6.2.2 采樣點選擇 采樣時使用GPS定位系統，用油漆、標記物或其他方法標記定位取樣點。

6.2.3 樣品保存及檢測準備 葉片裝入標簽登記好的干凈塑料袋內干燥保存，另外，準備2mL離心管、離心管架、粉碎機、一次性杯子、一次性筷子，提取液、蒸餾水、滴管等材料。

6.2.4 進行葉片快速檢測[7] （1）用清洗處理后的剪刀等裁剪工具，對葉片樣品進行均勻及初步碾碎；（2）取長2cm，寬0.5cm的葉片各2份，分別放置于2根2mL離心管中；（3）加入0.5mL的純凈水，用一次性筷子上下搓碎葉片直到液體呈現淡綠色，并依此在白紙上做好樣品信息標記；（4）將試紙條帶箭頭的一端朝下，注意試紙條下端浸入液面的深度不超過0.5cm；（5）觀察液面上升，3min后取出觀察；（6）結果判斷并記錄：在同等條件下檢測樣品，若試紙上分別出現控制線C和檢測線T，則結果為陽性（+），只出現一條控制線C，為陰性（-），C線未出現，則操作失誤或試紙條失效。

7 風險監測處置

7.1 推動轉基因農產品轉基因風險追溯制度的建立和實施 轉基因種子生產基地、轉基因農產品生產基地、加工企業等應當建立轉基因農產品生產檔案，記載供應商信息、生產批次、產量、銷量及供貨方提供的轉基因成分檢測情況說明，加強轉基因農產品風險監測，并建立農產品轉基因成分檢測（送檢/自檢）制度，完善不合格產品的處理措施。對產出的轉基因農產品要建立完善的質量追溯制度。

7.2 建立信息預警通報及防控機制 建立監測數據庫和數據信息化平臺，捕捉國內外轉基因安全事件，實現風險預警實時反應。著重對海量信息的篩選、分析、確證，實現對轉基因生物安全進行全程的動態監測和溯源，及時發現可能潛在的安全隱患，并針對性的對該品種開展田間作物或農產品的轉基因成分抽樣監測，掌握暴露風險水平。

7.3 開展農業轉基因生物風險等級評估 根據農業轉基因生物安全突發事件可能發生的數量、規模及其危害程度進行預測、分析、評估，對人類、動植物、微生物和生態環境的危險程度，將農業轉基因生物分為以下4個等級：安全等級I：尚不存在危險；安全等級Ⅱ：具有低度危險；安全等級Ⅲ：具有中度危險；安全等級Ⅳ：具有高度危險。

通過不同評估等級，確定預警級別，按特別嚴重、嚴重、較嚴重和一般等4個等級的預警分級響應，分別啟動相應應急預案。對安全等級Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的轉基因生物，在廢棄物處理和排放之前應當采取可靠措施將其銷毀、滅活，以防止擴散和污染環境；發現轉基因生物擴散、殘留或者造成危害的，必須立即采取有效措施加以控制、消除。

7.4 加強科普宣傳教育 轉基因技術作為一項新技術，研究和應用起步晚，公眾對轉基因技術及安全管理情況還不夠了解，監管責任主體可通過媒體、公眾活動日、專家座談會等多種渠道，宣傳農業轉基因生物技術基本知識及農業轉基因生物法律法規及安全管理制度等，及時向社會傳遞科學、權威、客觀的信息。

參考文獻

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（責編：張長青）