巴西蕉多酚氧化酶的基因克隆及序列分析

楊昭++何春蘭++黃佳佳++黃國平++李芬芳++袁德保

摘 要：基于香蕉基因組的信息，利用電子克隆方法獲得巴西蕉PPO基因，結合RT-PCR驗證，并通過生物信息學軟件對巴西蕉PPO進行序列分析。結果表明，成功獲得編碼巴西蕉PPO的新基因，序列長度為1 767bp，編碼588個氨基酸（GenBank登錄號：KF900300.1）。巴西蕉PPO基因與禾本科植物PPO基因有著較高的同源性，相似度在82%～85%，與薔薇科雞麻親緣關系最近。巴西蕉PPO最有可能存在于葉綠體中，不具有信號肽，含有一個長度為47個氨基酸的葉綠體轉運肽。巴西蕉PPO蛋白屬于酪氨酸酶基因家族蛋白，具有酪氨酸酶超級家族、PPO1_DWL和PPO1_KFDV3個保守結構域。巴西蕉PPO分子量為65.6 KDa，等電點為6.32，為親水性蛋白質。巴西蕉PPO二級結構中無規則卷曲占的比例最高為57.31%，成功預測得到巴西蕉PPO的三級結構模型。

關鍵詞：巴西蕉；多酚氧化酶；基因組；電子克隆

中圖分類號 Q785 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）11-0023-06

Cloning and Sequencing of the Brazilian Banana Polyphenol Oxidase

Yang Zhao1 et al.

（1Guangdong Food and Drug Vocational College，Guangzhou 510520，China）

Abstract：Based on the information about the banana genome，PPO gene of brazilian banana was cloned in silico，and validated by RT-PCR，and analyzed by bioinformatics software.New gene encoding brazilian banana PPO was successfully obtained，with sequence length of 1767bp，encoded a protein of 588 amino acids （GenBank accession number：KF900300.1）.Brazilian banana PPO gene has a high homology with gramineae plant PPO gene，and their similarity was between 82%～85%.Furthermore，brazilian banana PPO gene had the closest relationship with the rhodotypos scandens of rosaceae PPO gene.Brazilian banana PPO was most likely to exist in the chloroplast，without a signal peptide，but containing a chloroplast transit peptide with length of 47 amino acids.Brazilian banana PPO protein belonged to tyrosinase protein gene family，with three conserved domains of tyrosine enzyme superfamily，PPO1_DWL and PPO1_KFDV.Brazilian banana PPO with molecular weight of 65.6 KDa and an isoelectric point of 6.32，was a hydrophilic protein.The secondary structure of brazilian banana PPO in the proportion of random coil accounted for up to 57.31%.And the tertiary structure of brazilian banana PPO was predicted successfully.

Key words：Brazilian banana；Polyphenol oxidase；Genome；In silico cloning

多酚氧化酶（PPO，polyphenol oxidase）具有加氧酶和脫氧酶2種活性，是廣泛存在于動物、植物和真菌體內的一類與銅結合的金屬蛋白酶[1]。PPO是引起果蔬酶促褐變的主要內源酶，廣泛存在于植物體的各種組織中。在有氧條件下，PPO將果蔬中的多酚氧化酶氧化為醌類物質，醌類物質再聚合產生黑色素，從而引起果蔬褐變。如何抑制多酚氧化酶的活性，解決果蔬褐變問題，是國內外學者的研究熱點[2-5]。

近年來，越來越多的科學家熱衷于克隆植物PPO基因，用于基因結構及功能的研究，探究PPO的抑制機理，用于指導果蔬褐變控制。目前，已被克隆的植物PPO基因有茶葉[6]、梨[7]、蘋果[8]等20多種植物組織。香蕉被聯合國糧農組織定位為發展中國家的第四大糧食作物，是最大宗的熱帶亞熱帶水果，但其采后貯運損失嚴重，且深加工相對落后[9]。由多酚氧化酶引起的酶促褐變，是香蕉貯運保鮮及深加工中亟待解決的難題[10]。從分子水平研究香蕉PPO的基因結構和功能，是解決香蕉貯運保鮮及深加工中褐變問題的根本途徑[11]。

然而，目前國內外對香蕉PPO基因的研究非常有限。Gooding等從威廉斯蕉中克隆得到4種不同的PPO cDNA片段，并且用特異性引物擴增得到1條 2 078bp的全長PPO基因，但該PPO序列卻未在NCBI等數據庫中登錄[12]。Quansah等擴增得到Grand Nain香蕉PPO基因的部分序列，該基因編碼141個氨基酸[13]。譚琳等利用電子克隆的方法獲得1 602bp的香蕉PPO編碼序列，并進行了生物信息學分析，但未對電子克隆的香蕉PPO進行RT-PCR驗證[14]。二倍體香蕉DH-Pahang基因組的注釋里至少有9個多酚氧化酶的信息[15]，并且多個品種香蕉的PPO都被驗證存在同工酶[16]，所以香蕉PPO的基因序列存在多樣性。

巴西蕉是中國市場上最為重要和種植廣泛的香蕉品種[17]，但目前未有對其基因進行克隆的研究報道。為了挖掘更多的香蕉PPO基因信息，探究其結構和功能，為研究PPO的抑制機理打下基礎，本研究基于二倍體香蕉DH-Pahang基因組的信息，以巴西蕉為原材料，采用電子克隆的方法，結合RT-PCR及測序驗證，并用生物信息學軟件對驗證的巴西蕉PPO進行序列分析，以期為進一步研究香蕉PPO的基因結構和功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 巴西蕉（Musa acuminata L.AAA group CV.Brazilian）果實采摘于中國熱帶農業科學院海口實驗站實驗基地（福山實驗基地），采收時果實成熟度約為綠熟。將果肉和果皮分離后，分別用液氮速凍，置于

-70℃冰箱保存。試劑為SuperRT cDNA Kit（CW0741），北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設備 全自動高壓滅菌鍋，MLS-3780，日本SANYO公司；臺式高速冷凍離心機，MultifugeX3R，德國Heraeus公司；PCR儀，Tpersonal 48，德國Biometra公司；凝膠成像系統，G：BOX/EF2，美國Syngene公司；核酸電泳儀，DYCP-31F，北京市六一儀器廠。

1.3 總RNA提取和cDNA合成 RNA常規提取方法參照Asif等的方法進行優化[18]。cDNA合成采用康為世紀公司的SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒。

1.4 巴西蕉PPO基因的電子克隆 從NCBI的核酸數據庫檢索香蕉PPO基因序列，挑選物種親緣最近的基因序列作為探針，在NCBI數據庫中進行香蕉EST數據庫的Blast檢索（Blast站點Database選擇Expressed sequence tags），從中選取1個高度同源的EST序列在NCBI數據庫中進行香蕉WGS數據庫的Blast檢索，找到同源性較高的contig。接著用FGENESH軟件在線分析此contig，預測得到可能的香蕉PPO新基因序列。再用NCBI數據庫中的Blastx工具驗證此序列是不是PPO基因。最后在NCBI數據庫中進行Blast驗證其新穎性。

1.5 電子克隆巴西蕉PPO基因的RT-PCR驗證 根據電子克隆巴西蕉PPO基因序列的性質，設計并合成特異性引物FP1（5′-tcgatcc tgttctcggcttc -3′）和RP1（5′-cgatggtgcggcttttattttcc-3′）。PCR反應體系為：2×ES Master Mix 12.5μL，FP1（10uM）1μL，RP1（10uM）1μL，以巴西蕉果肉RNA為模板合成的cDNA 2μL，RNase-Free Water 8.5μL。反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環后72℃延伸5min。擴增結束后，取5μLPCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產物切膠回收后連接到pMD19-T載體上，隨后轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中。將PCR擴增驗證篩選獲得的陽性單菌落的菌液送往上海英駿生物技術有限公司測序。

1.6 巴西蕉PPO基因測序結果分析 利用ORF Finder工具對測序得到的巴西蕉PPO序列進行完整開放閱讀框架的分析。將測序得到的CDS序列與電子克隆基因序列通過EBI網站的ClustalW2軟件進行序列比對，檢驗序列的正確性。

1.7 巴西蕉PPO的序列分析 通過軟件Mega5.02繪制巴西蕉PPO與其他物種PPO基因的MP進化樹圖譜（Maximum Parsimony Trees），采用Bootstrap檢驗法，1 000次重復。利用CBS網站上的軟件Target P 1.1 Server通過預測氨基酸導肽形式來預測巴西蕉PPO的亞細胞定位。利用CBS網站上的軟件SignalP 4.1和ChloroP 1.1 Server分別對其信號肽和導肽形式進行在線預測。利用NCBI的Conserved Domains數據庫進行結構域分析及功能預測。利用EXPASY網站上的ProtParam工具對巴西蕉PPO進行一級結構分析。通過SOPM對巴西蕉PPO二級結構進行在線預測。通過同源建模服務器SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）對巴西蕉PPO三級結構進行預測，以自動建模模式（Automatic Modelling Mode）進行建模，利用RasMol軟件查看預測結果。

2 結果與分析

2.1 巴西蕉PPO基因的電子克隆 從NCBI的核酸數據庫檢索得到50個與香蕉多酚氧化酶有關的基因序列，只有EU880277.1是Musa acuminata AAA Group Cavendish banana polyphenol oxidase mRNA的部分序列。由于所研究的巴西蕉是Cavendish香蕉的亞種，所以用此序列作為探針在NCNI數據庫進行香蕉EST數據庫的Blast檢索，得到5個EST序列，只有ES436966.1與基因探針有96%的匹配率（圖1）。將ES436966.1序列在NCBI數據庫中進行香蕉WGS數據庫的Blast檢索，找到了2個contig_1794（CAIC01022631.1）和contig_1953（CAIC01022472.1）。序列比對顯示contig_1794（CAIC01022631.1）長度為56 431bp，與ES436966.1在24 483～25 362有99%的一致性，表明新巴西蕉PPO基因可能存在于contig_1794（CAIC01022631.1）之中。用FGENESH軟件在線分析contig_1794（CAIC01022631.1），獲得3個可能的巴西蕉PPO基因CDS序列，分別記為NBPPO1、NBPPO2和NBPPO3。NBPPO1長度為1 746bp，編碼581個氨基酸，存在于contig_1794（CAIC01022631.1）序列3 637～15 949bp，由18個外顯子序列構成。NBPPO2長度為1 773bp，編碼590個氨基酸，存在于contig_1794（CAIC01022631.1）序列23 550～25 322bp，由1個外顯子序列構成。NBPPO3長度為1 809bp，編碼602個氨基酸，存在于contig_1794（CAIC0 1022631.1）序列26 203～28 219bp，由2個外顯子序列構成。NBPPO1、NBPPO2和NBPPO3序列通過Blasx檢索后，只有NBPPO2序列能夠檢索到PPO同源蛋白，具有PPO1_DWL和PPO1_KFDV2個結構域，可以確定NBPPO2是巴西蕉PPO基因序列（圖2）。NBPPO2通過Blast新穎性檢測，NCBI數據庫中未發現與NBPPO2完全一致的基因序列，可以判斷NBPPO2是新的巴西蕉PPO基因。

BlastX結果

2.2 電子克隆巴西蕉PPO基因驗證

2.2.1 巴西蕉PPO基因的PCR擴增 以巴西蕉果肉總RNA為模板，合成cDNA第一鏈。然后以cDNA第一鏈為模板，用設計的特異性引物（FP1和RP1）進行PCR擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了2 100bp和1 050bp的2個條帶，且2 100bp條帶比1 050條帶片段更亮（圖3）。2 100bp的條帶與電子克隆得到的1 773bp的巴西蕉PPO基因大小接近。將2 100bp條帶切膠回收連接轉化，篩選獲得的陽性單菌落的菌液送往上海英駿生物技術有限公司測序，3個陽性克隆測序得到一致的cDNA序列，序列長2 116bp。

2.2.2 巴西蕉PPO基因測序結果分析 通過ORF Finder工具對所獲得的cDNA序列進行開放閱讀框架分析，發現其有2個完整的閱讀框架。較長的閱讀框架位于第350～2 116位，序列長1 767bp，推測編碼588個氨基酸。較短的閱讀框架位于第470～2 116位，序列長1 647bp，推測編碼533個氨基酸。在cDNA5′端第350位和第470位存在起始密碼子ATG，3′端的2116處存在終止密碼子TGA。測序得到巴西蕉PPO基因長的閱讀框架記為BXPPO1。將測序得到的巴西蕉PPO的CDS序列BXPPO1與電子克隆得到的CDS序列NBPPO2比較發現，整個序列中只有16個堿基的差異，這些差異的來源與品種差異有關。BXPPO1全序列經NCBI數據庫中的Blast工具查新確認后在GenBank中登錄，登錄號為：KF900300.1。表明利用電子克隆方法成功擴增得到巴西蕉PPO的CDS全長序列。

2.3 巴西蕉PPO基因序列分析

2.3.1 巴西蕉PPO基因同源性分析及進化樹圖譜的構建 用巴西蕉PPO的CDS序列在NCBI數據庫中進行Blastn搜索同源序列，發現其與禾本科（除高稈野生稻外）植物相似度約在82%～85%，與薔薇科（雞麻）相似度約72%。巴西蕉PPO與這幾個物種PPO的氨基酸序列比對表明，3個保守結構域中氨基酸序列比較保守，在保守區域之外，氨基酸序列差異較大。巴西蕉PPO基因進化樹分析結果表明，巴西蕉PPO基因與薔薇科和禾本科存在著相對較近的親緣關系，但與薔薇科雞麻（DQ851219.1）親緣關系最近（圖4）。

圖4 巴西蕉PPO與其他物種PPO進化樹分析

2.3.2 巴西蕉PPO的亞細胞定位 通過CBS網站上的軟件TargetP 1.1 Server預測蛋白N端導肽形式來預測蛋白質的亞細胞定位。預測結果（圖5）顯示導肽位點為cTP（葉綠體導肽）、mTP（線粒體導肽）、SP（信號肽）的可能分值分別為0.878、0.118和0.038，表明導肽位點為cTP（葉綠體導肽）的可能性最大，這也說明巴西蕉PPO存在于葉綠體的可能性最大。

2.3.3 巴西蕉PPO信號肽和轉運肽的預測和分析 通過SignalP4.1軟件對巴西蕉PPO信號肽進行預測，采用神經網絡的方法，對信號肽切割位點的預測用Y-score maximum來判斷，對分泌蛋白的預測用mean S-score來判斷。如果mean S-score大于0.5，則預測為分泌蛋白，含有信號肽，小于0.5則沒有信號肽。圖6顯示第21位的天冬氨酸殘基（N）具有最高的原始剪切位點分值0.179，第6位的賴氨酸（K）殘基具有最高的信號肽分值0.165，第21位的天冬氨酸殘基（N）殘基具有最高的綜合剪切位點分值0.154，分值都低于平均分值0.5，因此巴西蕉PPO不具有信號肽。

由于對巴西蕉PPO的預測分析表明其存在于葉綠體的可能性最大，所以通過軟件ChloroP 1.1 Server對其在葉綠體的轉運肽進行了預測。圖7顯示巴西蕉PPO存在轉運肽的可能性為0.549，大于0.5，因此認為巴西蕉PPO含有轉運肽，長度為47個氨基酸。

2.3.4 巴西蕉PPO結構域分析及功能預測 利用NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數據庫，對巴西蕉PPO可能有的功能結構域進行預測的結果如圖8。圖8顯示巴西蕉PPO蛋白屬于酪氨酸酶基因家族蛋白，有一個酪氨酸酶超級家族（Tyrosinase superfamily）的保守結構域，分布在168～375位的氨基酸之間，還具有2個典型的PPO1_DWL 和PPO1_KFDV保守結構域，分布在第380～435位和第457～584位的氨基酸。

2.3.5 巴西蕉PPO一級結構分析 利用ProtParam軟件對巴西蕉PPO一級結構分析如表1～表3所示，巴西蕉PPO分子式為C2952H4526N800O866S19，含有588個氨基酸，分子量為65688.3 Da，等電點（pI）為6.32。氨基酸含量表明，巴西蕉PPO中含量最高的氨基酸為亮氨酸（Leu），含有54個，占所有氨基酸含量的9.2%。其次為天冬氨酸（Asp）、脯氨酸（Pro）和天冬酰胺（Aln），分別含有49、47和46個，占所有氨基酸數目的8.3%、8.0%和7.8%。蛋白不穩定指數為40.92，表明其為不穩定蛋白。平均疏水性為-0.479，整條多肽鏈表現為親水性，表明巴西蕉PPO為親水性蛋白。

圖9是通過同源建模服務器SWISS-MODEL對巴西蕉PPO三級結構進行的預測。同源模建（homology modeling）是目前最為成功且實用的蛋白質結構預測方法，當2個蛋白質的序列同源性高于35%時，通常認為它們的三維結構基本相同[20]。巴西蕉PPO三級結構是基于PPO原子結構2p3x的A鏈模建的，兩者序列一致性達到63.53%，所以模建結果可以真實反映巴西蕉PPO的結構。

3 結果與討論

基于二倍體香蕉DH-Pahang基因組的信息，本研究利用電子克隆方法得到巴西蕉PPO基因序列，通過RT-PCR方法克隆獲得該基因，序列分析表明該基因是編碼巴西蕉PPO的新基因，序列長度為1 767bp，編碼588個氨基酸，并登錄GenBank，登錄號為：KF900300.1。通過各種生物信息學軟件對巴西蕉PPO的核酸序列和氨基酸序列進行了生物信息學分析。結果表明：巴西蕉PPO基因與禾本科（除高桿野生稻外）植物PPO基因有著較高的同源性，相似度在82%～85%，與薔薇科雞麻（DQ851219.1）親緣關系最近。巴西蕉PPO最有可能存在于葉綠體中，不具有信號肽，含有一個長度為47個氨基酸的葉綠體轉運肽。巴西蕉PPO蛋白屬于酪氨酸酶基因家族蛋白，具有酪氨酸酶超級家族、PPO1_DWL和PPO1_KFDV3個保守結構域。巴西蕉PPO分子式為C2952H4526N800O866S19，含有588個氨基酸，分子量為65 688.3Da，等電點為6.32，為親水性蛋白質。巴西蕉PPO二級結構中無規則卷曲占的比例最高為57.31%，其次是α螺旋為22.11%，而延伸鏈和β折疊所占的比例低，分別只有16.84%和3.74%。并成功預測得到巴西蕉PPO的三級結構模型。

由于植物基因組較大，基因組結構復雜，目前只有很少的植物基因組序列被測定[21]。利用基因組信息進行功能基因電子克隆的報道更少，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（GenBank登錄號：AY078072）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（GenBank登錄號：AF486280）是利用水稻基因組信息進行電子克隆得到功能基因的少有報道[22]。隨著基因組測序的發展，利用基因組信息進行電子克隆一定會成為功能基因克隆的重要方法。

本文利用二倍體香蕉DH-Pahang基因組的信息，采用電子克隆的方法，結合RT-PCR及測序驗證，獲得巴西蕉PPO的全長編碼序列，利用生物信息學的方法對巴西蕉PPO基因的結構和功能進行分析，對蛋白質的各種性質進行預測，為深入研究香蕉PPO基因的結構和功能奠定了基礎，為從根本上解決香蕉貯運保鮮及深加工中的褐變問題提供了理論支撐。

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（責編：張宏民）