進展期結直腸癌患者亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與卡培他濱耐藥及毒性反應的關系

龐明輝，梁麗芹，侯能易，胡雪梅，丁 玥，王 康(四川省醫學科學院·四川省人民醫院胃腸外科，四川 成都 610072)

進展期結直腸癌患者亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性與卡培他濱耐藥及毒性反應的關系

龐明輝，梁麗芹，侯能易，胡雪梅，丁 玥，王 康
(四川省醫學科學院·四川省人民醫院胃腸外科，四川 成都 610072)

目的 檢測進展期結直腸癌組織中MTHFR基因的表達，分析其與卡培他濱耐藥及毒性反應的關系。方法 56例進展期結直腸癌患者的病理組織，檢測MTHFRC677T位點的基因多態性，測試進展期結直腸癌患者原代腫瘤細胞對卡培他濱的響應。結果 MTHFRC677T位點TT型對卡培他濱化療的敏感例數及化療毒性反應例數均高于CC及CT型，且化療毒性反應例數均高于CC基因型，差異均有統計學意義(P< 0.05)。結論 進展期結直腸癌化療前應檢測MTHFR基因多態性，MTHFRC677T基因TT型患者首選卡培他濱，化療期間注意毒性反應的發生。

5-FU；卡培他濱；結直腸癌；體外藥效學；基因多態性

5-Fu是進展期結直腸癌最常用的氟尿嘧啶類藥物，在此基礎上，還衍生出了其他氟尿嘧啶類藥物，如替加氟、替吉奧、卡培他濱等。5-Fu進入體內在亞甲基四氫葉酸的參與下與胸苷酸合成酶形成穩定的復合物，干擾DNA的合成與修復。亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是5-Fu體內代謝過程中的關鍵酶之一[1]。卡培他濱是5-Fu的前藥，是進展期結直腸癌化療的氟尿嘧啶類基礎用藥。由于進展期結直腸癌對卡培他濱的反應差異，以及卡培他濱不可預期的毒副作用和耐藥，常常導致用藥劑量的降低和治療的中斷[2]，最終影響其化療效果。進展期結直腸癌患者卡培他濱耐藥及毒性反應與MTHFR基因多態性的關系有待闡明，研究表明影響MTHFR活性的基因多態位點中，C677T是最常見的位點。本文通過原代腫瘤細胞的體外藥效學試驗，從上述最常見位點入手，研究MTHFR基因多態性與卡培他濱毒副作用和耐藥性的關系，為指導臨床個體化化療用藥提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1～6月四川省人民醫院收治的56例進展期結直腸癌患者的病理組織，均經病理確診。所有患者病歷資料完整，化療前后均有全面的體格檢查和實驗室檢查(包括肝功能、腎功能、心電圖等)。年齡(59.6±13.2)歲，其中男37例，女19例；高分化30 例，中低分化26 例；41例有淋巴結轉移。術后均采用以卡培他濱為主的化療方案。標本采集程序符合四川省人民醫院人體樣本實驗研究倫理規范。

1.2 方法

1.2.1 ATP生物熒光腫瘤藥物敏感性試驗(ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP- TCA) 卡培他濱以20×5-Fu(購自日本東京化成工業株式會社，貨號:E0748)代替[3]。用DMSO溶解配置成濃度為0.5 mg/ml的儲存液，-20 ℃保存。ATP- TCA檢測試劑盒購自湖州海創生物科技有限公司，按照試劑盒說明操作進行原代腫瘤細胞分離、細胞培養及ATP檢測。抗癌藥物工作液藥物濃度設定為6個梯度，即200%、100%、50%、25%、12.5%、6.25%的藥物測試濃度(test drug concentration，TDC)。分析軟件根據抗癌藥物各濃度抑制率計算得出藥物IC90及IC50(IC90:抑制 90%腫瘤細胞生長的 TDC；IC50:抑制 50%腫瘤細胞生長的 TDC。CSI =500-各TDC的抑制率之和。判定標準:化療敏感性根據以下三種進行分類::IC50≤25%TDC為敏感； IC90≤100% TDC 且 IC50 >25%，或CSI≤300為輕度敏感；IC90>100% TDC 且 IC50>25%且 CSI>300為耐藥[4]。

1.2.2 基因多態性檢測 從石蠟包埋的腫瘤組織切片中提取DNA，操作過程參照試劑盒說明書(TAKARA，DEXPAT)。擴增的上游引物[5]為:5'- CCTTGAACAGGTGGAGGCC-3'；下游引物為 5'- CAAAGAAAAGCTGCGTGATGAT-3'，擴增片段長 158 bp。PCR反應體系總體積 25 μl，包括引物(10 mmol/L)各1.0 μl、4×dNTP(各2.5 mmol/L) 2.5 μl、Taq酶1U、基因組DNA溶液0.5 μl、10×Buffer(含MgCl2)2.5 μl。反應條件為 95 ℃預變性5 min；變性 95 ℃30 s；退火58 ℃30 s；延伸72 ℃30 s，共35個循環；72 ℃延伸 7 min。PCR擴增產物加入HinfI 限制性內切酶反應后于3%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.3 近期毒性反應評價 觀察化療2周期內不良反應發生情況。是否出現腹瀉、惡心、白細胞減少、血小板減少、手足綜合癥、肝腎功受損、骨髓抑制、脫發等不良反應發生情況。

1.4 統計學方法 用SPSS 10.0軟件統計分析。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFRC677T基因型頻率 檢出TT純合型 6例(10.7%)，CT雜合型16 例(28.6%)，CC野生型34例(60.7%)。通過哈迪-溫伯格平衡檢驗發現，在直腸癌患者中MTHFR677基因型分布差異無統計學意義，均符合Hardy- Weinberg 遺傳平衡規律，表明本研究入組病例具有群體代表性。

2.2 MTHFR基因多態性與ATP體外藥敏結果的關系 MTHFR667 TT純合型敏感例數高于CC及CT基因型，差異均有統計學意義(χ2=4.519，χ2=4.200；P< 0.05)。

表1 MTHFR677基因多態性與體外藥敏結果的關系

2.3 MTHFRC677T基因多態性與臨床相關的早期毒性的關系 56例患者化療毒副反應主要表現為出現Ⅱ度以上肝損傷3例，骨髓抑制2例，手足綜合癥4例，口腔炎2例，腹瀉1例。TT基因型患者的毒性反應發生例數顯著高于CC型，差異有統計學意義(χ2=3.971，P< 0.05)，但與CT型比較，差異無統計學意義(P> 0.05)，見表2。

表2 MTHFR 677基因型與毒性反應的關系 [n(%)]

3 討論

卡培他濱是5-Fu的前藥，可以明顯改善無疾病生存期，是進展期結直腸癌化療的常用藥物。Schuller等報道[6]，每天兩次口服1255 mg/m2卡培他濱，在原發結直腸癌組織中5-Fu的濃度平均是正常組織的3.2倍，腫瘤組織/血漿的5-Fu濃度比值超過20，而其他組織的比值為8～10。在體外藥敏試驗中，一般設定的TDC參照血漿峰值濃度設定，因此本研究以20倍的5-Fu血藥濃度來模擬卡培他濱的體外藥效學試驗。當臨床上有多個可以接受的等效化療方案時，體外藥效學實驗是一個有效的優化治療方案的選擇[7]。本研究采用的ATP-TCA是一種敏感和穩定的體外藥效學方法，它與臨床療效相關性高[8]。

MTHFR是葉酸代謝通路上的關鍵代謝酶，會影響5-Fu的毒性與臨床應答[9]。研究顯示，以卡培他濱為基礎的化療方案能夠提高晚期胃腸道腫瘤患者血清中 MTHFR濃度，抗腫瘤療效確切[10]。在不同人種和地區中，該酶的基因多態性分布存在差異。本研究人群中，MTHFRC677T位點TT型對卡培他濱化療的敏感性高于CC及CT型，原因有以下兩個方面:①C677T位點CT的突變可導致該蛋白222位氨基酸由丙氨酸轉變為纈氨酸，而此處氨基酸的轉變將使MTHFR酶的穩定性和活性降低[11]；②突變會增加細胞內 5，10亞甲基四氫葉酸的含量，進而增強對胸苷酸合成酶的抑制作用，使癌細胞對5-FU的敏感性增高，進而增強氟尿嘧啶類藥物的抗腫瘤活性[12]。Cohen 等[13]報道43例接受以 5-FU 為主的一線治療的晚期結腸癌患中，C667T的基因多態性與腫瘤反應率密切相關，TT基因型患者的有效率達100%，而CC與CT基因型患者的有效率分別為47%和67%。

進展期結直腸癌患者對化療藥物的敏感性方面存在個體差異，腫瘤的耐藥性是化療失敗的主要原因，而大約50%的耐藥性是用藥前就已經存在。可以更可靠地評估化療的毒副作用和耐藥的風險，建立更個性化的治療方案，避免無效治療，提高腫瘤治療效果。本研究提示進展期結直腸癌化療前可以常規檢測亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態性，重點關注C677T，其中TT型患者首選卡培他濱作為化療藥物。

本研究結果顯示，攜帶 MTHFRC677T位點TT基因型患者的化療毒性反應尤其是手足綜合征和骨髓抑制，顯著高于CC型患者[14]。提示進展期結直腸癌卡培他濱化療期間注意毒性反應，加強對TT基因型患者手足綜合征和骨髓抑制的預防和處理。

目前研究表明，檢測惡性腫瘤患者外周血白細胞DNA中相關基因多態性可能對于指導晚期消化道癌的化療、預測以5-FU為基礎的化療方案的療效具有較高的臨床價值[15]，本研究提取腫瘤細胞中DNA檢測相關基因多態性亦顯示相同效果。我們研究提示MTHFR基因有可能作為進展期結直腸癌化療耐藥性的預測指標，建議進展期結直腸癌化療前檢測MTHFR基因多態性，對于MTHFRC677T位點TT型患者，化療藥物首選卡培他濱，藥物治療期間需注意手足綜合征和骨髓抑制的毒性反應。

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The relationship between MTHFR polymorphism and capecitabine resistance and toxicity reaction in advanced colorectal cancer

PANGMing-hui,LIANGLi-qin,HOUNeng-yi，HUXue-mei,DINGYue，WANGKang
(DepartmentofGastrointestinalSurgery,SichuanAcademyofMedicalScience&SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,China)

WANGKang

Objective To detect methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene expression in advanced colorectal cancer tissue, and analyze its association with capecitabine resistance and toxicity reaction. Methods We collected 56 cancer tissue samples from patients with advanced colorectal cancer. We detected the polymorphism at MTHFRC677T loci and measured the response of colorectal primary tumor cells to capecitabine. Results The incidence of sensitivity to and chemotherapy toxicity reaction to capecitabin in TT genotype was higher than those in CC genotype and CT genotype at MTHFRC677T loci (P< 0.05). Conclusion MTHFR gene polymorphism has to be detected before chemotherapy for patients with advanced colorectal cancer. The capecitabine is the preferred drug for patients with TT genotype of MTHFR gene. The toxic reaction should be paid attention during period of chemotherapy.

5-Fu； Capecitabine； Colorectal cancer； In vitro pharmacodynamics； Gene polymorphism

王 康

R735.3

A

1672-6170(2016)05-0156-03

2016-04-16；

2016-07-22)