膽道損傷愈合過程中cIAP-1及caspase3的表達及其意義

駱 樂，姚豫桐，李可洲，黃孝倫(.四川省醫學科學院·四川省人民醫院外七病區，四川 成都 6007；.四川大學華西醫院肝膽胰外科，四川 成都 6004)

膽道損傷愈合過程中cIAP-1及caspase3的表達及其意義

駱 樂1，姚豫桐1，李可洲2，黃孝倫1
(1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院外七病區，四川 成都 610072；2.四川大學華西醫院肝膽胰外科，四川 成都 610041)

目的 觀察凋亡調控蛋白cIAP1及其下游凋亡因子caspase3在膽道良性狹窄形成過程中的表達和定位情況，并探討其意義。方法 建立膽管損傷后愈合犬模型，分別利用原位雜交檢測技術及免疫組織化學過氧化酶標記的鏈霉卵白素(Streptavidin Peroxidase Method，SP)法對犬膽道損傷愈合不同時期的組織中cIAP1及caspase3的表達和定位情況進行分析。結果 cIAP1于各時間點均顯著性表達(P< 0.05)，定位于間質細胞，以成纖維細胞為甚；各組間差異無統計學意義(P> 0.05)。Caspase3表達明顯弱于對照組(P< 0.05)，腺上皮表達相對較強，各期之間差異無統計學意義(P> 0.05)。cIAP-1mRNA與caspase3蛋白表達呈負相關(r=-0.97，P< 0.05)。結論 抗凋亡基因cIAP-1通過抑制其下游凋亡因子caspase3可能在膽道損傷后的瘢痕愈合轉歸中發揮重要作用。

膽道；原位雜交；免疫組化；凋亡；cIAP1；caspase3

組織損傷愈合機制的探索一直是人們關注的焦點，有學者認為，造成不同愈合轉歸的最終原因在于成纖維細胞的某些基因的表達改變[1]。而膽管組織以它特有的環境使其愈合變得更加復雜，膽汁復雜的成分以及膽管細胞特有的某些性質使損傷后的炎癥細胞處于持續性的激活狀態，以致各種炎癥因子，細胞因子不斷被釋放，形成一個慢性持續性的炎癥環境，最終導致成纖維細胞的持續增殖，瘢痕形成[2]。因此，在膽道組織愈合過程中，有可能某些基因的表達發生了改變，并直接導致了成纖維細胞的持續增殖。本研究通過免疫組化及原位雜交的手段分別對凋亡因子caspase3及凋亡抑制基因cIAP-1的表達進行分析，探討其在良性膽管狹窄形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的制備 本地健康雜交犬30只，雌雄不限，體重(12.6±2.1)kg。分籠飼養，隨機分為實驗組和對照組各15只。術前晚禁食，氯胺酮4 mg/kg及速眠醒0.1 ml/kg肌肉注射誘導麻醉，上肢靜脈穿刺補液，青霉素320萬U加入10%葡萄糖氯化鈉注射液中，術中靜滴。經右上腹肋緣下弧形切口入腹，首先距十二指腸上緣2 cm處游離出膽總管(上下游離范圍不超過1 cm)，實驗組橫向切開膽總管前壁，范圍約為其周徑1/2，以5-0不吸收絲線作膽總管壁全層吻合，針距0.4～0.5 mm，邊距0.3～0.4 mm。術畢探查吻合口無滲漏，于肝腎隱窩放置引流管后關腹。對照組游離膽總管后直接關腹。術后于皮下注射生理鹽水補液并預防感染治療3天，3天后拔除腹腔引流管。

1.2 標本采集及檢測 分別于術后2、3、4、5及6月取材，每次取材6只，實驗組和對照組各3只。切取吻合口連同上、下1 cm 組織，4%多聚甲醛溶液，PBS(pH 7.0～7.6)含有1/1000 DEPC固定，常規脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊后行4 μm連續切片，HE染色，光鏡觀察。免疫組化染色采用SP 法，第一抗體caspase3兔抗狗 IgG(北京博奧森)，二抗羊抗兔IgG(北京中杉金橋)，三抗堿性磷酸酶標記鏈酶親和素；AP-Red試劑盒(北京中杉金橋)。原位雜交采用AP法，針對cIAP-1基因mRNA(GenBank，No.XM-006266)的多聚寡核苷酸探針序列(5′to3′)：5′-dig-TGCGTATCAAGAACTCACACCTGGGAAACC -3′。染色步驟按AP 試劑盒說明進行；堿性磷酸酶顯色，蘇木素復染，封片，觀察。用已知cIAP-1及caspase3的陽性切片作陽性對照，用PBS液分別代替一抗、二抗及三抗作陰性對照。每張切片隨機選取5個互不重疊的高倍鏡視野，進行統計。

1.3 判定標準 陽性細胞評定標準：以細胞漿染成紅色為陽性細胞。應用Image pro plus10.5 圖像分析軟件，對各組切片平均表達強度進行定量分析，即測量其平均光密度值(mean Intensity Optical Density，mIOD)。

1.4 統計學方法 采用PASW Statistics 18統計軟件包進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間及組內比較采用重復測量數據的方差分析及Bonferroni、LSD檢測；cIAP-1與caspase3表達的關系采用spearman相關性分析。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 實驗組1犬術后15天死于腹腔感染，另有1犬術后9天死于膽漏，為保證樣本量，于同樣條件下按上述造模方法，另外補入新樣本。其余犬只食欲、反應尚可。

2.2 組織學觀察 各組均有慢性炎癥細胞浸潤，纖維組織增生并分割腺上皮，灶性淋巴濾泡形成的現象，為典型的慢性炎癥表現。其中2、3、4月均有膽管壁，上皮下的灶性充血及出血現象。并有不同程度的腺體擴張。而5、6月出現腺體深陷肌層的表現，這可能是纖維增生所造成的腺體移位。由此可見，膽管損傷愈合后即處于慢性持續性的炎癥環境中，管壁結構明顯破壞，纖維組織大量增生是其主要的病理改變。

2.3 原位雜交結果 兩組各時間點瘢痕組織cIAP-1基因表達差異均有統計學意義(P< 0.05)。實驗組上皮下間質組織有明顯陽性表達結果，而腺上皮鮮有表達。主要定位于纖維組織，胞漿染色呈鮮紅色。炎癥細胞包括淋巴細胞及單核巨噬細胞等以及血管內皮細胞等也有不同程度表達，見表1，圖1a。對照組僅腺體組織有弱陽性表達，見圖1b。實驗組各時間點差異無統計學意義(P> 0.05)。

2.4 免疫組化結果 如表2，圖1c，兩組各時間點瘢痕組織caspase3表達差異均有統計學意義(P< 0.05)，呈現弱表達狀態，上皮細胞表達明顯強于間質組織；如圖1d，對照組于上皮及間質內均有程度不等的陽性結果。實驗組各時間點差異無統計學意義(P> 0.05)。

2.5 相關性分析 膽道損傷愈合過程中，cIAP-1mRNA與caspase3蛋白表達呈負相關(r=-0.95，P< 0.01)。

圖1 兩組術后不同時間點瘢痕組織cIAP-1mRNA及caspase3蛋白表達 a：實驗組cIAP-1mR -NA于間質組織大量表達，腺體染色較淺(×400)；b：對照組腺體及間質組織均無明顯染色(×400)；c：實驗組caspase3總體表達弱，腺體染色相對較強；d：對照組caspase3腺體及間質組織均有表達

表1 術后不同時間點兩組cIAP-1和caspase3表達情況比較

*與對照組比較，P< 0.05

3 討論

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族是一類保護某些細胞在遭受各種刺激的情況下免于程序性死亡的蛋白超家族。首先是從桿狀病毒基因組克隆到，包括cIAP-1、cIAP-2、XIAP、survivin、BRUCE，及ML-IAP等。這其中cIAP-1、cIAP-2、XIAP的大部分結構具有同源性。它們的氨基末端均含有3個肽段BIR重復序列，羧基端則均含有1個高度保守的鋅指結構域，這使其具有泛素E3的活性。IAPs抑制細胞凋亡主要通過兩種方式[3]：①通過BIR序列與Caspase的蛋白質-蛋白質作用，IAP可以直接抑制Caspase-3、7和9的作用；②通過RING序列，IAP可以催化Caspase-3和-7泛素化，導致這些Caspase被蛋白酶體降解。這兩種途徑均可抑制caspase3活性，從而達到抗凋亡的作用。由此，我們選擇檢測caspase3表達作為評價IAPs在膽道損傷愈合過程中抗凋亡作用的另一視點。目前，IAPs基因在某些原發性腫瘤中被發現過度表達。Issei等[4]通過熒光原位雜交的方法研究食管鱗狀細胞癌株(esophageal squamous cell carcinomas，ESCs)染色體11q21-q23中出現放大效應的靶基因時發現：cIAP-1基因呈現持續性過度表達狀態即放大效應。而Ashley等[5]于最近發現XIAP在肺纖維化形成過程中也起重要作用。病理性瘢痕形成過程表現為成纖維細胞的過度增殖，這與某些基因的表達調控關系密切。有學者利用基因芯片技術證實，普通瘢痕與瘢痕疙瘩相比，有402條基因的表達有區別，其中有250條基因上調，152條基因下調，有8種凋亡基因表達過低[6]。Messadi等[7]通過標記定量研究發現，正常皮膚成纖維細胞凋亡率，比瘢痕疙瘩高兩倍，凋亡相關基因表達也下降。由此可見，凋亡基因表達改變對病理性瘢痕的形成起較大作用。

膽道環境下的損傷愈合同樣以瘢痕形成，成纖維細胞過度增殖為轉歸，我們相信在此過程中，某些凋亡基因的上調起到了關鍵性作用。本實驗中，我們觀察到，作為細胞凋亡的主要調控者之一的cIAP-1于各時間點均為強陽性表達，證明cIAP-1處于過度表達狀態，凋亡嚴重受阻，增殖與凋亡失衡。也不難理解最終的瘢痕形成及攣縮所造成的膽管狹窄。從另一方面來看，此結果也說明了刺激因素的持續性，即慢性持續性的炎癥背景的形成。NF-KB作為炎癥信號介導的關鍵性核因子啟動了下游眾多基因的表達，包括IAPs基因在內的幾個重要的抗凋亡基因如：cIAP-1、cIAP-2、XIAP、bcl-2、bcl-xl、c-FLIP等[8]。Messadi等[9]研究發現，瘢痕疙瘩成纖維細胞較正常皮膚在NF-KB激活及其相關下游基因包括腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF-receptor-associated factors，TRAF)1，TRAF2，cIAP-1的表達方面表現出更高的基礎水平。因此，膽管愈合過程中，有可能是慢性炎癥的持續使NF-KB得以不斷被激活，并迅速進入核內啟動下游靶基因持續性表達。另外，從定位來看，cIAP-1過度表達于成纖維細胞，而膽管上皮細胞幾乎未表達，這表明在凋亡抵抗方面，成纖維細胞較膽管上皮細胞有明顯的優勢。進一步證明膽管組織愈合以成纖維細胞的大量增殖修復為主。究其原因，可能與膽管上皮細胞所特有的膜結構膽酸轉運蛋白(apical sodium-dependent bile acid transporter，ASBT)有關。后者負責膽管上皮對膽酸的攝取，其表達量受膽汁成分的調節[10]。有研究表明[11]，膽管上皮細胞內膽酸濃度的改變，可通過Ca2+，P13K，PKC等信號通路影響細胞的增殖、凋亡、分泌及基因表達。因此，有可能是膽道損傷愈合過程中的膽汁內環境的變化使其表達發生改變，進而影響了膽管上皮細胞對膽汁成分地攝取及反應，通過復雜的信號網絡傳導，最終導致NF-KB的激活減少或cIAP-1基因表達直接受到抑制，其具體機制有待進一步探究。我們在實驗中還發現cIAP-1在炎癥細胞如單核巨噬細胞，淋巴細胞及血管內皮細胞均有不同程度表達，這或許將直接導致這些炎性細胞凋亡失敗，從而大量增殖并分泌炎癥介質，進而造成炎癥的持續。

Caspase即半胱氨酸特異性蛋白酶，又稱凋亡蛋白酶，是哺乳動物中與線蟲死亡基因產物ced-3同源且具有相同作用的一類半胱氨酸蛋白酶家族[12]，是各種凋亡信號傳導的共同終末。激活的Caspase可以水解約100個底物，包括細胞調節、細胞信號轉導、DNA修復、組織平衡、細胞存活等環節中重要的蛋白，從而使細胞表現為凋亡特有的形態學及生化特征：細胞皺縮、斷裂，染色質聚集，DNA降解，以及隨后的凋亡細胞被吞噬細胞迅速地清除等。許多影響細胞凋亡的基因，如p53、bcl-2、Fas、Rb 等；細胞因子，藥物等均可以通過調節caspase活化發揮作用。caspase3的序列和功能與ced-3最為接近，能特異地在天冬氨酸殘基的位置剪切底物蛋白，而自己本身在細胞凋亡中也在天冬氨酸的位置被剪切為兩個片斷，即前體Caspase3(35 kD)在Asp28和Ser29之間及Asp175和Ser176之間進行剪切，產生有活性的17 kD亞基和12 kD的亞基[13]。因此，caspase3的表達將直接反應細胞凋亡的程度。我們在實驗中發現，caspase3于各時間點均弱表達，且結締組織弱于腺上皮，但均低于正常組。說明膽道愈合過程中伴有細胞失凋亡，并且以結締組織最為明顯。我們通過相關分析還發現，cIAP-1mRNA表達與caspase3蛋白表達呈負相關，證明兩者在調控膽管組織愈合過程中的細胞凋亡方面有著較為密切的關系。或許可以這么認為，膽道修復過程中，cIAP-1作為caspase3上游的凋亡調控因子，其過度表達至少部分導致了caspase3的失活，凋亡抑制，最終造成纖維細胞的大量增殖，造成最終的膽道狹窄形成。

我們或許可以通過適當抑制IAPs基因表達以增加膽道愈合過程中的成纖維細胞的凋亡進程，從而達到遏制成纖維細胞過度增殖的狀態，軟化瘢痕，最終避免膽道良性狹窄的形成。

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The expression and significance of caspase3 and cIAP-1 in the wound healing process of bile duct

LUOLe1，YAOYu-tong1，LIKe-zhou2，HUANGXiao-lun1
(1.TheSeventhWardofDepartmentofSurgery，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople'sHospital，Chengdu610072，China；2.DepartmentofHepatopancreatobiliarysurgery，WestChinaSchoolofMedicine/WestChinaHospitalofSichuanUniversity，Chengdu610041，China)

HUANGXiao-lun

Objective To observe the expression and localization of the apoptosis regulation protein cIAP1 and its downstream factor caspase3 in the course of the formation of benign biliary stricture and to explore its significance.Methods After establishment of canine model for healing after bile duct injury，expression and localization of cIAP1 and caspase3 in biliary tissue at different stages of healing were analyzed by using in situ hybridization technique and immunohistochemical peroxidase labeled avidin-streptavidin (Streptavidin Peroxidase Method，SP) method，respectively.Results cIAP1 was significantly expressed at all time points (P< 0.05).The expression was located in the interstitial cells，especially in fibroblasts.There was no significant difference among the healing stages (P> 0.05).The expression of caspase3 in the experimental group was significantly less than that in the control group (P<0.05).The expression in epithelial cells was relatively stronger.There was no significant difference among the healing stages (P> 0.05).There was a negative correlation between cIAP-1 mRNA and caspase3 protein (r =-0.97，P<0.05).Conclusion The inhibition of caspase3 by cIAP-1 may play an important role in scar-less healing after bile duct injury.

Biliary；In situ hybridization；Immunohistochemistry；Apoptosis；cIAP1；Caspase3

黃孝倫

R657.4

A

1672-6170(2016)05-0087-04

2015-12-10；

2016-03-24)