MiR-125a誘導(dǎo)表達(dá)與順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株凋亡相關(guān)性的研究

胡瓊英，艾承錦，張 爽，熊大千，江澤友，趙梓亦，張朝明(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院.檢驗(yàn)科；.科研部中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610071)

MiR-125a誘導(dǎo)表達(dá)與順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株凋亡相關(guān)性的研究

胡瓊英a，艾承錦a，張 爽a，熊大千a，江澤友a(bǔ)，趙梓亦b，張朝明a
(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院a.檢驗(yàn)科；b.科研部中心實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610071)

目的 探討順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株TW03微小RNA-miR-125a表達(dá)情況，為順鉑治療鼻咽癌的耐藥性尋找新的分子靶點(diǎn)和標(biāo)志物。方法 建立順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株TW03 細(xì)胞模型(TW03/DDP)，提取細(xì)胞中的總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)分析該細(xì)胞株中miR-125a表達(dá)情況，過表達(dá)miR-125a和anti-miR-125a后，檢測TW03細(xì)胞的凋亡和增殖情況。結(jié)果 順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株中miR-125a的表達(dá)增高，后者可抑制順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株凋亡。結(jié)論 順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株誘導(dǎo)表達(dá)miR-125a可抑制鼻咽癌細(xì)胞株凋亡。

鼻咽癌；順鉑抵抗； miR-125a；凋亡

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是東南亞及我國東南地區(qū)好發(fā)的惡性腫瘤之一，在我國發(fā)病呈南高北低趨勢，發(fā)病率為20/10萬～30/10萬，而在歐美的發(fā)病率<1/10萬，發(fā)病有明顯的種族、地區(qū)和家族聚集現(xiàn)象，以青壯年男性為主[1]。鼻咽癌的治療以放療為主，但約有30%的放療患者預(yù)后較差，臨床上常常使用順鉑進(jìn)行化療，促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡[2]。然而，順鉑化療的突出問題是產(chǎn)生藥物耐性，即順鉑抵抗，制約了鼻咽癌化療的療效[3]。探討順鉑抵抗的下游機(jī)制，是研究順鉑耐藥機(jī)制的關(guān)鍵。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為22個(gè)核苷酸的小非編碼RNA分子，可以調(diào)控真核細(xì)胞的基因表達(dá)、增殖、分化、凋亡等一系列生物學(xué)行為[4，5]。據(jù)報(bào)道，miR-125a與腫瘤細(xì)胞的分化、遷移和侵襲等生物學(xué)行為密切相關(guān)，其功能的實(shí)現(xiàn)主要通過翻譯后調(diào)控靶基因如ERBB2/3、BAK1和p53來實(shí)現(xiàn)，而后者是調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞凋亡的靶基因。本研究進(jìn)一步研究順鉑耐藥誘導(dǎo)的miR-125a表達(dá)情況及其調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響，探索順鉑抵抗的下游分子機(jī)制，以期為鼻咽癌的化療應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 鼻咽癌細(xì)胞株TW03由美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)提供，順鉑耐藥的TW03耐藥株(TW03/DDP)的獲取是將TW03細(xì)胞與含順鉑(300 nM)DMEM培養(yǎng)基(Gibco Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)共孵育3周篩選而來，最終TW03耐藥株的順鉑篩選濃度穩(wěn)定為10 μM。

1.2 轉(zhuǎn)染 將TW03細(xì)胞接種于12孔板，每孔密度為5×105個(gè)，轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體2000 (Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)，與miRNA共孵育48小時(shí)，轉(zhuǎn)染后的TW03細(xì)胞用冰磷酸鹽緩沖液沖洗，收集細(xì)胞，待分析。miR-125a的mirVana miRNA mimic批號(hào)為MC12378，miR-125a的mirVana?miRNA inhibitor批號(hào)為12378，均購自Life Technologies (Carlsbad，CA，USA)公司，使用濃度為5 nM。

1.3 提取RNA和RT-qPCR分析miRNAs 使用Trizol (Life Technologies)試劑盒提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，提取RNA的濃度通過測量在260 nm處的吸光度值分析待用。實(shí)時(shí)RT-PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒miScript SYBR-Green PCR Kit(Qiagen，Mississauga，ON，Canada)分析提取的RNA。miR-125a的引物和內(nèi)部質(zhì)控U6 snRNA購自Qiagen。

1.4 CCK8試劑盒分析TW03細(xì)胞凋亡情況 轉(zhuǎn)染后的TW03細(xì)胞接種于96孔板，每孔密度為2.5×104個(gè)，加入混有DDP (1～15 μM)的培養(yǎng)基，共孵育24、48 和 72小時(shí)，然后加入CCK8試劑(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)，每孔10 μl，37 ℃孵育4小時(shí)，在450 nm和590 nm波長檢測吸光度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株(TW03/DDP)對(duì)順鉑治療的反應(yīng)性及has-miR-125a表達(dá) 順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株相對(duì)于正常TW03細(xì)胞株而言，隨著順鉑用藥濃度的增加，對(duì)癌細(xì)胞的活性抑制作用無明顯變化(圖1a)。進(jìn)一步檢測miR-125a在順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株和正常TW03細(xì)胞株兩組中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其在順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株中高表達(dá)(圖1b)。

2.2 順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株轉(zhuǎn)染miR-125a拮抗基因(miR-125a-ASOs)后對(duì)順鉑的反應(yīng)性 為了進(jìn)一步確定miR-125a對(duì)順鉑抵抗的誘導(dǎo)作用，拮抗順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株中miR-125a(has-miR-125a-ASOs)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-125a-ASOs后TW03細(xì)胞株對(duì)順鉑用藥濃度的反應(yīng)更為敏感，隨著順鉑濃度的增加，TW03癌細(xì)胞的活性抑制作用增強(qiáng)(圖2)。

圖1 順鉑抵抗的確定及miR-125a的表達(dá)情況 a:順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株(TW03/DDDP)和普通鼻咽癌TW03細(xì)胞株對(duì)順鉑濃度變化的反應(yīng)情況；b:RT-PCR檢測順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株(TW03/DDDP)和普通鼻咽癌TW03細(xì)胞株中miR-125a的表達(dá)情況。

圖2 過表達(dá)miR-125a-ASOs后順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株對(duì)順鉑的反應(yīng)情況

2.3 過表達(dá)miR-125a可誘導(dǎo)鼻咽癌TW03細(xì)胞株的順鉑抵抗作用 為了闡明miR-125a與順鉑抵抗的關(guān)系，過表達(dá)miR-125a(miR-125a mimic)，發(fā)現(xiàn)與未治療組比較，30 μM順鉑作用下，轉(zhuǎn)染miR-125a mimic組TW03細(xì)胞凋亡比例最小,與未轉(zhuǎn)染和過表達(dá)miR-125a-ASOs組比較，轉(zhuǎn)染miR-125a mimic組在順鉑的作用下抑制癌細(xì)胞生長比例最高(圖3a，圖3b)；順鉑作用后，隨著時(shí)間的推移，過表達(dá)miR-125a后普通的鼻咽癌細(xì)胞株TW03組與順鉑抵抗的鼻咽癌細(xì)胞株TW03組比較，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(圖4)。

圖3 過表達(dá)miR-125a抑制鼻咽癌細(xì)胞株TW03凋亡情況

圖4 過表達(dá)miR-125a對(duì)鼻咽癌細(xì)胞株TW03增殖的抑制情況 *與TW03/DDP比較，P < 0.05

3 討論

已有文獻(xiàn)證實(shí)，microRNAs廣泛參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。Wang等[6]研究了miR-429負(fù)性調(diào)控鼻咽癌的機(jī)制，認(rèn)為其可以成為鼻咽癌治療和預(yù)后的監(jiān)測指標(biāo)；Xu等[7]報(bào)道，miR-124-3p可通過下調(diào)STAT3的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞凋亡和抑制其增殖；Ou等[8]報(bào)道m(xù)iR-21可被STAT3激活，從而通過PTEN-AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡；Deng等[9]發(fā)現(xiàn)miR-214通過AKT信號(hào)通路負(fù)性調(diào)控乳運(yùn)鐵蛋白的表達(dá)，從而負(fù)性調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞的生長；Liu等[10]證實(shí)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶 4(CDK4)和miR-15a是鼻咽癌發(fā)病機(jī)制的反饋刺激因子，并可誘導(dǎo)化療藥物耐受。有關(guān)microRNAs與順鉑化療抵抗的關(guān)系，已有部分文獻(xiàn)報(bào)道:Shen等[11]研究MicroRNA-137可降低順鉑藥物在肺癌化療的敏感性；Zhou等[12]報(bào)道下調(diào)microRNA-375可以通過調(diào)節(jié)ERBB2增加順鉑對(duì)胃癌細(xì)胞的化療敏感性。有關(guān)miR-125a在癌癥中的研究，已有文獻(xiàn)報(bào)道:Dai等[13]顯示miR-125a可通過血管內(nèi)皮生長因子A調(diào)節(jié)胃癌血管形成。Lehmann等[14]認(rèn)為miR-125a等可以作為乳腺癌分級(jí)、受體狀態(tài)和分子類型的潛在分子標(biāo)志物。盡管文獻(xiàn)基礎(chǔ)有關(guān)順鉑耐藥的microRNAs和miR-125a在其他癌癥中的應(yīng)用已有報(bào)道，但目前有關(guān)miR-125a在順鉑對(duì)鼻咽癌耐藥中的研究還未見報(bào)道，探索miR-125a在順鉑抵抗的鼻咽癌治療過程中的作用，對(duì)鼻咽癌的化療非常重要。

本研究證實(shí)順鉑抵抗的鼻咽癌TW03細(xì)胞株對(duì)順鉑治療反應(yīng)性降低并高表達(dá)has-miR-125a，miR-125a是順鉑耐藥誘導(dǎo)的關(guān)鍵基因，順鉑抵抗時(shí)，其表達(dá)顯著增高，可抑制癌細(xì)胞的凋亡，對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用也顯著降低。為了進(jìn)一步闡述miR-125a在順鉑抵抗中的作用，本實(shí)驗(yàn)過表達(dá)了miR-125a(miR-125a mimic)和anti-miR-125a (miR-125a-ASOs)，研究干預(yù)miR-125a基因?qū)樸K耐藥的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):去除miR-125a基因的影響，順鉑耐藥情況得到有效改善，鼻咽癌細(xì)胞的凋亡率增加，增殖率降低；反之，加強(qiáng)miR-125a基因的影響，可促使順鉑耐藥的發(fā)生，鼻咽癌細(xì)胞的凋亡率降低，增殖率增加。所以本研究證實(shí)miR-125a是順鉑耐藥的關(guān)鍵靶位點(diǎn)，這一發(fā)現(xiàn)可能為順鉑化療耐藥的解決找到新的分子靶點(diǎn)，也為下一步研究miR-125a調(diào)控順鉑抵抗的分子機(jī)制打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] Chen WS，Li JJ，Hong L，et al.Diagnostic value of magnetic resonance spectroscopy in radiation encephalopathy induced by radiotherapy for patients with nasopharyngeal carcinoma:a meta-analysis[J].Biomed Res Int，2016，2016:5126074.

[2] Yang L，Hong S，Wang Y，et al.Development and external validation of nomograms for predicting survival in nasopharyngeal carcinoma patients after definitive radiotherapy[J].Sci Rep，2015，5:15638.

[3] Guo SS，Tang LQ，Zhang L，et al.The impact of the cumulative dose of cisplatin during concurrent chemoradiotherapy on the clinical outcomes of patients with advanced-stage nasopharyngeal carcinoma in an era of intensity-modulated radiotherapy[J].BMC Cancer，2015，15:977.

[4] Hu QY，Jiang H，Su J，et al.MicroRNAs as biomarkers for hepatocellular carcinoma:a diagnostic meta-analysis[J].Clin Lab，2013，59(9-10):1113-1120.

[5] 陳學(xué)斌，王國春.miRNA在特發(fā)性炎性肌病中的作用[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2015，12(5):17-22.

[6] Wang F，Jiang C，Sun Q，et al.Downregulation of miR-429 and inhibition of cell migration and invasion in nasopharyngeal carcinoma[J].Mol Med Rep，2016[Epub ahead of print].

[7] Xu S，Zhao N，Hui L，et al.MicroRNA-124-3p inhibits the growth and metastasis of nasopharyngeal carcinoma cells by targeting STAT3[J].Oncol Rep，2016，35(3):1385-1394.

[8] Ou H，Li Y，Kang M.Activation of miR-21 by STAT3 induces proliferation and suppresses apoptosis in nasopharyngeal carcinoma by targeting PTEN gene[J].PLoS One，2014，9(11):e109929.

[9] Deng M，Ye Q，Qin Z，et al.miR-214 promotes tumorigenesis by targeting lactotransferrin in nasopharyngeal carcinoma[J].Tumour Biol，2013，34(3):1793-800.

[10] Liu Z，Cheng C，Luo X，et al.CDK4 and miR-15a comprise an abnormal automodulatory feedback loop stimulating the pathogenesis and inducing chemotherapy resistance in nasopharyngeal carcinoma[J].BMC Cancer，2016，16(1):238.

[11] Shen H，Wang L，Ge X3，et al.MicroRNA-137 inhibits tumor growth and sensitizes chemosensitivity to paclitaxel and cisplatin in lung cancer[J].Oncotarget，2016，[Epub ahead of print].

[12] Zhou N，Qu Y，Xu C，et al.Upregulation of microRNA-375 increases the cisplatin-sensitivity of human gastric cancer cells by regulating ERBB2[J].Exp Ther Med，2016，11(2):625-630.

[13] Dai J，Wang J，Yang L，et al.miR-125a regulates angiogenesis of gastric cancer by targeting vascular endothelial growth factor A[J].Int J Oncol，2015，47(5):1801-1810.

[14] Lehmann TP，Korski K，Gryczka R，et al.Relative levels of let-7a，miR-17，miR-27b，miR-125a，miR-125b and miR-206 as potential molecular markers to evaluate grade，receptor status and molecular type in breast cancer[J].Mol Med Rep，2015，12(3):4692-4702.

The relationship between MiR-125a induction expression and apoptosis of cisplatin resistant nasopharyngeal carcinoma cell line

HUQiong-ying1，AICheng-jin1，ZHANGShuang1，XIONGDa-qian1，JIANGZe-you1，ZHAOZi-yi2，ZHANGChao-ming1
(a.DepartmentofLaboratoryMedicine，b.CentralLaboratory，TeachingHospitalofChengduUniversityofTCM，Chengdu610072，China)

ZHANGChao-ming

Objective To search the novel molecule targets or biomarkers for cisplatin resistant patients with nasopharyngeal carcinoma (NPC)，we detected the expression levels of miR125a in cisplatin resistant TW03 cells (TW03/DDP).Methods After construction of a cisplatin resistant TW03 cell model (TW03/DDP)，the expression levels of miR125a were examined by RT-qPCR.After over expression of miR-125a and application of anti-miR-125a，the apoptosis and proliferation of TW03 cells were examined.Results In the TW03/DDP cells，the expression levels of miR125a were up-regulated.The cisplatininduced expression of miR125a inhibited apoptosis of the TW03 cells.Conclusion The present study revealed that induction of the expression of miR125a by treatment with cisplatin results in resistance to the cisplatin drug in the NPC cells.

Nasopharyngeal carcinoma； Cisplatin resistance； miR-125a； Apoptosis

成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(編號(hào):030029045)

張朝明

R739.62

A

1672-6170(2016)05-0043-04

2016-05-10；

2016-06-24)