不同頻率超聲聯合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對微循環功能變化的實驗研究

阿麗米娜·阿文，關麗娜，虎曉梅，穆玉明(新疆醫科大學第一附屬醫院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

不同頻率超聲聯合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對微循環功能變化的實驗研究

阿麗米娜·阿文，關麗娜，虎曉梅，穆玉明
(新疆醫科大學第一附屬醫院心臟超聲診斷科，新疆 烏魯木齊 830054)

目的 觀察不同頻率超聲聯合靶向微泡、尿激酶在體溶栓后對微循環功能的影響。方法 18只新西蘭大白兔單側股動脈制成富含血小板的混合性血栓模型，分為A、B、C3組各6只。均通過靶向微泡攜帶尿激酶在超聲照射30 min下輔助溶栓，其中A組超聲頻率1.6 kHz，B組2.2 kHz，C組2.8 kHz。應用脈沖多普勒血流儀持續監測血流流速，對血流量變化特點進行分析，并對各組脛前肌行HE染色，比較不同頻率超聲的溶栓作用及對微循環功能變化的影響。結果 溶栓后120 min時，三組血流量變化比較，差異有統計學意義(P< 0.05)，其中B組與A、C組比較實現了完全再通。A、C組均有未溶通或者微栓塞情況發生。經HE染色后發現C組微循環末端有微小栓子，成分為由嗜酸性同質性纖維素構成，鏡下呈粉紅色。結論 超聲頻率2.2 MHz的條件下溶栓可以實現血栓的完全溶解，遠端未見微栓子形成，栓子處于完全溶解狀態。

超聲；靶向微泡；溶栓；微循環；微栓塞

血栓形成和血栓栓塞后斑塊的破裂產生的碎片及微循環栓塞是任何一個血管手術術后有可能發生的一種并發癥，靜脈使用溶栓藥物的副作用主要是引起出血，其操作復雜、有創、易引發血管壁損傷或發生遠端小血管栓塞的缺點，而體表超聲助溶不但能有效溶解血栓并且能夠使溶栓更加徹底，減少微循環栓塞的發生[1]。有研究報道，在目前先進的支架及手術技術基礎上，栓塞率有所下降，微循環栓塞這種并發癥的死亡率由過去的4%～17%下降到了0.9%，因此如何減少微循環再栓塞無疑對治療血管性疾病起到重要作用[2]。既往研究結果顯示，應用診斷超聲聯合靶向微泡攜帶尿激酶可以完全溶解股動脈內血栓[3]，但同時發現，在實現了靶向血管內血栓的有效溶解后，其末端的分支小血管出現了不同程度的再閉塞。因此，為進一步研究其可能的原因，本研究通過選取不同超聲頻率聯合靶向微泡、尿激酶對兔股動脈血栓進行溶栓，探討不同頻率超聲溶栓后對微循環功能及微血栓形成的影響因素與意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型制備 18只新西蘭大白兔，由新疆醫科大學動物中心提供，體質量1.8～2.8 kg，戊巴比妥鈉(30～40 mg/kg)麻醉，建立靜脈通道，仰臥位固定，腹股溝區脫毛，備皮，鈍性分離組織，分離股動脈，結扎其相應的深支和淺支。在該段股動脈后壁放置大小為2.5 cm×2.5 cm 的橡膠薄膜，以保護動脈周圍組織。在橡膠薄膜與股動脈后壁放置一大小約0.5 cm×0.5 cm的浸有15%三氯化鐵溶液濾紙片將股動脈環繞包裹，接觸面約為股動脈周徑的3/4，待血流穩定后，將股動脈的遠端用動脈夾夾閉，7～8 min后取出動脈夾，約20 min后取出濾紙片，用生理鹽水沖洗局部組織。所有動物的處置均經過新疆醫科大學倫理委員會同意(批件號:20140403003)并按照相關規定處理。血栓模型制作成功的標準:①在30 min內形成完全閉塞性血栓；②脈沖多普勒流儀血流量<0.05 ml/min；③二維和彩色多普勒超聲顯示閉塞性血栓；④經HE染色證實為以血小板為主的混合件混合性血栓。以上標準如有1項不符合即為陰性結果。終止實驗標準:自制作模型開始觀察，總觀察時間120 min后終止實驗[4]。

1.2 方法 將0.3 ml的TagestarSA超聲微泡與生物素化尿激酶(3 ml)及生物素化RGDS(3 ml)三者混勻，于室溫條件下孵育20分鐘，期間不斷輕微震蕩。待血栓形成后，經耳緣靜脈通道緩慢注射。將LA523探頭置于血栓處，選擇爆破條件，待微泡到達血栓處，曝破約10 min，待股動脈內完全看不到造影劑即可停止爆破。使用LA240探頭，頻率1～4 MHz，照射血栓處30 min，觀察兩小時。將脈沖多普勒血流計的血流量恢復正常基礎血流四分之三以上定義為完全溶通，進一步用二維和彩色多普勒超聲加以確定。實驗結束后即刻結扎遠、近端血管，取出血管后，予過量麻醉藥處死動物，切開兔前肢小腿前側皮膚，鈍性分離筋膜組織，取脛前肌組織2 cm×1.5 cm，厚度為0.2 cm，標本用4%福爾馬林溶液固定，常規脫水，石蠟包埋切片，HE染色，觀察組織末端血管內有無微血栓存在。

1.3 溶栓療效評價指標 血管再通率: CDFI或血管造影進行評價，以血管再通(達I級:僅見細窄血流通過)為標準[5]，判斷各組溶栓治療后血管的再通率。

1.4 統計學方法 應用SPSS 23.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，不服從正態分布，采用秩和檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組血流量的比較 不同時間段比較三組血流量變化情況，溶栓后120 min時，三組血流量變化比較，差異有統計學意義(P< 0.05)，其中B組與A、C組比較實現了完全再通。見表1。

表1 不同超聲頻率下溶栓后120 min內股動脈血流量情況 (ml/min)

2.2 三組溶栓后血管的溶通情況及發生微栓塞的情況 根據CDFI血流頻譜觀察實驗結果:三組溶栓后血管的溶通情況及發生微栓塞的情況:A組溶栓后血管部分未溶通，但未發生微栓塞；B組溶栓后血管均完全被溶通，沒有發生微栓塞；C組溶栓后有部分血管未溶通，發生了微栓塞。見表2。

2.3 各組超聲檢查結果 觀察不同條件下溶栓后血管溶通的情況溶通組:CDFI可見血流通過，未通組:CDFI未見血流通過。見圖1。

表2 不同超聲頻率下溶栓后血管溶通情況及發生微栓塞的情況

2.4 溶栓后兔脛前肌鏡下表現 18只動物中14只血管內血栓均完全溶解，4只未溶通。其中的1只出現了微循環再栓塞，光鏡下可見組織存在較明顯的瘀血和出血，白細胞聚集，組織呈蠟樣變性，提示骨骼肌壞死，微血管中由血小板纖維素和/或紅細胞組成，HE 染色呈粉紅色，證明微血栓形成。見圖2。

圖1 靶向微泡、尿激酶溶栓后血管再通的超聲及造影圖像 a:溶通組超聲下CDFI血流通過； b:未通組超聲下CDFI未見血流通過；c:溶通組造影可見造影劑顯影；d:未通組造影下造影劑未顯影

圖2 溶栓后脛前肌組織血管鏡下表現 a:溶通組未發生微栓塞；b:纖維素及血小板組成的粉紅色血栓，略透明，箭頭所指為微血栓形成 (HE染色，×400)

3 討論

溶栓后微循環產生的碎片導致微循環栓塞，是溶栓治療最主要最嚴重的并發癥。本研究也證實，應用不同超聲頻率聯合靶向微泡、尿激酶溶栓，雖然可以溶解血栓，但在末端分支小血管內也可能出現小的碎片。因此，及時發現微小栓子對減少微循環栓塞有重要意義。

通過超聲聯合微泡溶栓可能會使血栓破碎成小塊，但如果碎片大于下游毛細血管的直徑，這就會增加二次栓塞的風險[6，7]，研究發現溶栓后可能存在有大小約30～150 μm的游離血栓隨著大栓子脫落至管壁，繼而隨血液循環流動至血管的細小分支導致微循環末端的再次栓塞[8，9]。這種小的栓塞結構經病理HE染色鏡下可見其內部為團塊狀的纖維蛋白結構，觀察其周圍發現一些散在的紅色顆粒，考慮可能為沉淀的紅細胞，相比這種較小的栓子，當血栓直徑小于150 μm時，血管內可見有纖維素和紅細胞組成的粉紅色物質，于之前看到的單純的紅細胞聚集形成的血栓不同，在病理HE染色時發現此時鏡下的細胞呈粉紅色，這種粉紅色的物質為微血栓。

血凝塊碎片的大小在很大程度上取決于超聲照射強度[10，11]。研究表明超聲可有效促進血栓溶解，當超聲與溶栓藥物聯合溶栓時，可增加溶栓藥物的療效，使溶栓時間由3 h縮短至30 min[12]。另外，體外溶栓實驗結果顯示，高強度超聲在脈沖模式下會誘發血凝塊溶解，這種技術取決于空化效應和組織使用聚焦超聲波的頻率，由于脈沖時間短(<50個周期)、壓力高(>6 MPa)，相對于非線性脈沖空化作用低(0.1%～5%)，可在較短的時間內分離出組織碎片。在血管溶栓治療的應用中，多普勒超聲可有效反饋溶栓情況，5 MHz超聲診斷儀被用于監測與治療血栓疾病，若在超聲溶栓的過程中，不斷增加頻率的范圍，首先出現的不良反應為對機體有傷害作用，而且溶栓效果也并沒有較低頻率溶栓的結果理想，使用頻率較低的超聲具有通過體積較大的聲波作用來改進穿透力與定位的優點[13]。

研究表明[14]，超聲頻率2.2 kHz，超聲照射時間30 min，尿激酶劑量為3 mg時，將溶栓時間控制在10～60 min，隨超聲照射時間的延長，超聲溶栓效果越明顯。因此本實驗依據要求將超聲照射血栓處的時間控制在30 min，我們既往的研究中[15]，由于使尿激酶有了靶向性，成功地降低了尿激酶的劑量(3 mg)，雖然實現了靶向血栓的有效溶解，但可能也存在一部分的尿激酶在血液中被中和后失活，進而導致血液中尿激酶濃度減低，血栓的溶解片段過大，致微循環的再栓塞，因此藥物尿激酶的適量濃度也將影響血栓片段大小。不但實現了血管的溶通，并且沒有發生碎片，病理證實無微栓塞發生。而其他兩組，均有血管未通或(和)微栓塞發生，考慮其可能的原因是由于超聲在助溶的同時，可能會對遠端小血管產生一定影響，造成血栓溶解片段過大，隨微循環在末端分支小血管產生微小的碎片，因此選取適當的超聲頻率對減少微循環的栓塞有一定的作用。

[1] Weem SMOP，Haelst STWV，Ruijter HMD，et al.Lack of Evidence for Dual Antiplatelet Therapy after Endovascular Arterial Procedures: A Meta-analysis[J].European Journal of Vascular & Endovascular Surgery，2016,52(2):253-262.

[2] Lu Y，Wang J，Huang R，et al.Microbubble-Mediated Sonothrombolysis Improves Outcome After Thrombotic Microembolism-Induced Acute Ischemic Stroke[J].Stroke，2016,47(5):1344-1353.

[3] 關麗娜，穆玉明，王春梅，等.尿激酶RGDS微泡在體溶栓的血流頻譜特點與可能機制的實驗研究[J].中華超聲影像學雜志，2010，19(11):997-1000.

[4] 關麗娜，穆玉明，王春梅，等.影響動脈血栓形成因素的超聲研究[J].中國超聲醫學雜志，2011，27(10):873-877.

[5] Mu Y，Li L，Ayoufu G.Experimental study of the preparation of targeted microbubble contrast agents carrying urokinase and RGDS[J].Ultrasonics，2009，49(8):676-681.

[6] .Pacella J，Chen X，Brands J，et al.Abstract 15990: Microbubble-Mediated Sonothrombolysis With Long Tone Burst Ultrasound for the Treatment of Microvascular Microembolization: An in vivo Study[J].Circulation，2013，128(22):A15990.

[7] Maxwell AD，Cain CA，Duryea AP，et al.Noninvasive Thrombolysis Using Pulsed Ultrasound Cavitation Therapy- Histotripsy[J].Ultrasound in Medicine & Biology，2009，35(12):1982-1994.

[8] Cameron W，Kullervo H，David G.In vitro and in vivo high-intensity focused ultrasound thrombolysis.[J].Investigative Radiology，2012，47(4):217-225.

[9] Zhang X，Owens GE，Gurm HS，et al.Noninvasive thrombolysis using histotripsy beyond the intrinsic threshold (microtripsy)[J].IEEE Transactions on Ultrasonics Ferroelectrics & Frequency Control，2015，62(7):1342-1355.

[10]Pacella JJ，Brands J，Schnatz FG，et al.Treatment of Microvascular Micro-embolization Using Microbubbles and Long-Tone-Burst Ultrasound: An inVivo，Study[J].Ultrasound in Medicine & Biology，2015，41(2):456-464.

[11]Porter TR，Radio S，Lof J，et al.Diagnostic Ultrasound High Mechanical Index Impulses Restore Microvascular Flow in Peripheral Arterial Thromboembolism[J].Ultrasound in Medicine & Biology，2016，42(7):1531-1540.

[12]Merouani S，Hamdaoui O，Rezgui Y，et al.Sensitivity of free radicals production in acoustically driven bubble to the ultrasonic frequency and nature of dissolved gases[J].Ultrasonics Sonochemistry，2015，22:41-50.

[13]Tomkins AJ，Schleicher N，Murtha L，et al.Platelet rich clots are resistant to lysis by thrombolytic therapy in a rat model of embolic stroke[J].Experimental & Translational Stroke Medicine，2015，7(1):1-9.

[14]Jian Z，Zhaoyun C，Xiaoqiang Q，et al.Investigation of the long-term patency of a transmural heparinized polycaprolactone and poly(D，L-lactic/glycolic acid) scaffold.[J].Journal of Surgical Research，2014，187(2):394-402.

[15]關麗娜，王春梅，穆玉明，等.超聲介導下攜尿激酶靶向微泡在兔動脈內溶栓后的電鏡觀察[J].中華超聲影像學雜志，2011，20(9):799-802.

The changes of microcirculation function after in vivo thrombolysis by using targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency

ALIMINAA-Wen，GUANLi-na,HUXiao-mei,MUYu-ming
(DepartmentofEchocardiography，TheFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

MUYu-ming

Objective Objective To observes the effect of targeted microbubbles with urokinase under different ultrasound frequency on the microcirculation function after in vivo thrombolysis. Methods Eighteen New Zealand white rabbits were divided into A, B and C groups, 6 in each group after establishing a mixed thrombus model richer with platelets in unilateral femoral artery. Auxiliary thrombolysis was performed by using the target microbubbles with urokinase under ultrasound for 30 min, in which the group A

ultrasonic frequency was 1.6 MHz, the group B 2.2 MHz and the group C 2.8 MHz. Blood flow velocity was monitored by using a pulse Doppler blood flow meter and blood flow changes were analyzed. Meanwhile, samples of tibialis anterior muscles were stained by HE and the effects of thrombolysis under different ultrasonic frequency on microcirculation function were compared. Results After 120 min of thrombolysis, blood flow changes were significantly different among the three groups (P< 0.05), in which the group B achieved complete recanalization. There was incomplete recanalization or microemboli in another two groups. The HE staining showed that there was a small dose of microembolism composed of eosinophilic homogeneity of cellulose with pink color under microscopy. Conclusion The ultrasonic frequency 2.2 MHz, irradiation time 30 min, and urokinase of 3 mg thrombolysis can completely dissolve thrombus and can effectively prevent the microembolus formation.

Ultrasound； Targeted microbubble； Thrombolysis； Microcirculation； Micro embolism

國家自然科學基金資助項目(編號:81301230)

穆玉明，男，博士，主任醫師，教授，博士生導師。中華醫學會超聲醫學分會常委，中華醫學會分會第七屆委員會淺表組織和血管超聲學組副組長，中華醫學會超聲醫學分會第八屆超聲心動圖學組副組長，中國醫師協會超聲醫師分會常務委員，中國超聲醫學工程學會常務理事，中國超聲醫學工程學會超聲心動圖專業委員會副主任委員，中國醫學影像技術研究會超聲分會常務委員，新疆超聲醫學工程學會會長，新疆醫學會超聲專業委員會主任委員。研究方向:心血管超聲。

540.4+5

A

1672-6170(2016)05-0015-04

2016-07-20)