牛LF基因結構和功能的生物信息學分析

寧素恒，徐 軍，李強子，張 麗

（1.寧夏農墾賀蘭山奶業有限公司，寧夏銀川 750024；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730030）

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牛LF基因結構和功能的生物信息學分析

寧素恒1，徐 軍1，李強子2，張 麗2

（1.寧夏農墾賀蘭山奶業有限公司，寧夏銀川 750024；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730030）

摘 要：本試驗采用生物信息學方法預測和分析牛乳鐵蛋白基因（LF）編碼產物的理化特性、結構功能、信號肽、N-糖基化位點及其同源進化關系，以期為牛的抗病分子育種和經濟性狀相關基因篩選提供理論依據。研究結果顯示牛LF基因編碼708個氨基酸，產物為一種不穩定的水溶性蛋白，二級結構以a-螺旋為主，還有6個糖基化位點。蛋白功能以信號轉導、脅迫應答和免疫應答的概率相對較高，這表明LF基因可能在牛免疫應答和生長調節過程中發揮重要作用，能對牛的抗病力和生產性能起作用。同源進化關系來看，牛LF基因與馬的親緣關系最近。因此LF基因可作為荷斯坦牛抗病育種的候選基因進行進一步研究。

關鍵詞：牛；LF基因；抗病育種；生物信息學

文獻著錄格式:寧素恒，徐軍，李強子，等.牛LF基因結構和功能的生物信息學分析［J］.浙江農業科學，2016，57（6）: 904-907.

徐 軍（1978—），男，寧夏青銅峽人，畜牧師，本科，從事奶牛育種與疾病防治研究工作，E-mail: 409967130@qq.com。

乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）是一種天然活性鐵結合糖蛋白，廣泛存在于動物的乳汁、血液、唾液、小腸液等外分泌液中，具有抑菌、抗病毒感染、免疫調控、激活免疫應答及溶菌酶再生等生理功能［1-2］。將乳鐵蛋白運用于動物生產中可以顯著降低動物缺鐵性貧血發病率、提高動物免疫力和改善腸道微生態環境，促進動物健康生長。牛LF基因被定位于牛的第22號染色體上［3］。研究發現牛的乳鐵蛋白濃度可遺傳（h2=0.4）［4］。Molenaar等［5］研究表明患有乳腺炎的牛乳腺組織中LF基因的表達量比未患有乳腺炎的牛群體高，說明LF基因表達與炎癥反應相關聯。此外，Dinesh等［6-10］通過研究均表明牛LF基因多態性與牛的泌乳性狀和乳腺炎抗性密切相關。基于LF基因的可遺傳性以及與乳腺炎的相關性，可以對LF基因的結構和功能進行進一步的深入研究。

為深入探討牛LF基因的理化性質和生物學功能，避免該基因演化造成的差異，本研究利用生物信息學方法對牛LF基因序列結構及相關生物信息學特征進行預測和分析，同時構建系統發育進化樹，為揭示該基因理化性質、功能信息、遺傳特性及相關生理機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 牛LF基因序列

從GeneBank中查找得到牛的LF基因的編碼區序列（Codingsequences，CDS）（Genebank no.NC-007320）。

1.2 方法

對牛LF基因CDS編碼產物的氨基酸序列、其蛋白質特性及功能結構域進行分析與預測。所用工具軟件與網址為開放閱讀框分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），編碼蛋白質理化質分析（http://web.expasy.org/protparam/），編碼蛋白質疏水性/親水性分析（http://web.expasy.org/protscale/），編碼蛋白質的N-糖基化位點分析（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），編碼蛋白質二級結構預測（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl？page=npsa-sopma.html），編碼蛋白質三級結構（http://swissmodel.expasy.org/和PyMOL軟件），編碼蛋白質的信號肽跨膜區預測（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），編碼蛋白質的功能預測（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/），同源系統發育進化樹分析（DNAStar軟件中的MegAlign程序）。

2 結果與分析

2.1 牛LF基因序列的開放閱讀框（ORF）

開放閱讀框為基因從起始密碼子到終止密碼子之間的一段核苷酸序列。牛LF基因ORF分析結果如圖1，全長為2 127 bp。5′端起始密碼子是ATG，3′端終止密碼子是TAA，編碼蛋白質由708個氨基酸組成。

圖1　牛LF基因CDS區的ORF分析

2.2 牛LF基因編碼氨基酸理化性質的預測

牛LF基因編碼708個氨基酸，20種氨基酸所占比例亮氨酸（Leu）數目最多（表1），占整個氨基酸組成的10.3%，甲硫氨酸（Met）數目最少，占0.7%，負電荷殘基總數（Asp + Glu）為76，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為92，其分子式為C3449H5437N965O1022S40，分子質量為10.913 ku，半衰期為30 h，基因編碼產物不穩定指數為40.99，大于40，表明該基因編碼產物不穩定［11］。

表1　牛LF編碼蛋白的氨基酸組成

2.3 牛LF基因編碼蛋白質的理化性質

牛LF基因編碼氨基酸序列親水性/疏水性預測結果如圖2所示，其中第7位丙氨酸（Ala）疏水性最強（+2.400）；第243位的天冬氨酸（Asp）親水性最強（-2.882）。整條氨基酸肽鏈中，親水氨基酸占62.15%，疏水氨基酸占37.85%，總平均疏水性為-0.328，表現為親水性，因此，可推斷牛LF基因編碼的蛋白質是一種可溶性蛋白。

圖2　牛LF基因編碼蛋白的疏水性預測結果

2.4 牛LF基因編碼蛋白質N-糖基化位點的預測

蛋白質糖基化是真核生物蛋白質翻譯后加工的重要修飾之一，蛋白質糖基化修飾對蛋白質折疊、分選及其定位有重要影響，使用在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/對LF基因N-糖基化位點進行預測，結果如圖3所示。牛LF基因編碼蛋白氨基酸序列中存在6個潛在的N-糖基化位點。

2.5 牛LF基因編碼蛋白質的二級結構和三級結構預測

使用在線軟件http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa-automat.pl？page=npsa-sopma.html對牛乳鐵蛋白二級結構組分進行分析，其中a-螺旋（Hh）占34.89%，β-折疊（Ee）占19.49%，β-轉角（Tt）占11.44%，無規則卷曲（Cc）占34.18%。乳鐵蛋白二級結構中，Hh占主導地位。三級結構見圖4，從預測結果來看，三級結構主要成分為Hh，與二級結構預測結果一致。

圖3　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白N-糖基化位點

圖4　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白的三級結構模型預測

2.6 牛LF基因編碼蛋白質的功能預測

牛LF基因編碼蛋白質的功能預測見表2，該蛋白信號轉導、脅迫應答和免疫應答的概率相對較高，分別為0.985，0.830和0.357，這表明LF基因可能在牛免疫應答和生長調節過程中發揮重要作用，可能對牛的抗病力和生產性能起作用。

表2　牛LF基因編碼蛋白質的功能預測

2.7 牛LF基因編碼蛋白質信號肽跨膜區的預測

信號肽是決定新生肽鏈在細胞中的定位或決定某些氨基酸殘基修飾的一些肽段。在線軟件http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/分析結果顯示（圖5），牛LF基因編碼產物C值為0.728，Y值為0.819，S值為0.961，其切割點位于19～20位的氨基酸之間，基本可以判定LF基因編碼產物存在信號肽。

圖5　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白質信號肽跨膜區

2.8 牛LF基因編碼蛋白的同源序列分析

使用DNAStar軟件對6個物種的LF基因編碼產物序列進行同源性分析。由圖6可知，LF基因幾乎在所有的哺乳動物中都有表達。從進化樹分析結果來看，進化樹分為兩支，其中靈長目、偶蹄目和奇蹄目聚為一類，嚙齒目聚為一類。其中牛LF基因親緣關系與馬最近，這一結果符合動物分類學分類標準。

圖6　荷斯坦牛LF基因編碼蛋白質的氨基酸系統進化樹

3 討論

在哺乳動物中，LF基因是基因組中多態性較豐富的區域，對LF基因遺傳變異進行生物分析可以提供物種的遺傳多樣性信息，對動物種質資源的保護具有重要的生物學意義。同時LF基因與牛的繁殖性狀存在關聯性［12］。因此對LF基因的生物信息學分析也對實際生產有一定的幫助。

蛋白質結構決定其功能特點，進而影響其生命活動的代謝。牛LF基因CDS區序列全長2 127 bp，編碼708個氨基酸，編碼產物為不穩定蛋白。研究表明，蛋白質半衰期越長則蛋白質穩定性越高［13］，而本研究發現LF編碼產物氨基酸具有較長的半衰期（30 h）卻是不穩定蛋白，出現這一特性可能與其不同生理功能的發揮存在某種聯系。糖基化是真核生物蛋白質翻譯后重要的修飾之一，它可以影響蛋白質的抗原決定簇、電荷性質、熱穩定性、免疫分子的結構和功能，從而影響機體對抗原的應答反應［14］，它還可以調控蛋白質在組織和細胞中的定位、功能和活性［15］，糖基化位點發生變化可能與疾病的發生有關［16］，因此荷斯坦牛LF基因蛋白上潛在的糖基化位點可能會影響基因與病原相關分子的連接綁定，從而影響機體對乳腺炎的抵抗力。研究表明，無規則卷曲易受側鏈相互影響而改變空間構象，a螺旋和無規則卷曲是蛋白質肽鏈中構成配體受體結合的活性部位［17］，LF基因編碼蛋白二級結構中大量的無規則卷曲可能影響蛋白質肽鏈的結合活性，從而影響蛋白質的功能。荷斯坦牛LF基因編碼蛋白的信號轉導、脅迫應答、免疫應答和生長因子的概率相對較高，其中免疫應答和生長因子的概率最高，說明該基因可能對荷斯坦牛的免疫力和生產力具有較高的調節能力；LF基因可能在荷斯坦牛免疫應答過程中發揮重要作用，可能對荷斯坦牛的抗病力起作用［18］。

為了保證研究結果的準確性，本研究對各類型的預測均選用了多種不同軟件，不同算法，并進行多次預測。預測所得結果一致性較高，具有較高的可信度。對牛LF基因的研究將有利于對該基因及其編碼蛋白功能的進一步分析，了解牛LF基因與相關疾病的遺傳效應可以為利用LF基因改良牛經濟性狀提供參考。

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（責任編輯：盧福莊）

中圖分類號：S823

文獻標志碼：A

文章編號：0528-9017（2016）06-0904-04

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160635

收稿日期:2016-02-15

基金項目:西北民族大學引進人才科研項目（xbmuyjrc201316）；西北民族大學國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201510742084）

作者簡介:寧素恒（1984—），男，山西榆社人，助理畜牧師，本科，從事奶牛育種與繁殖工作，E-mail: 107154324@qq.com。

通信作者:張 麗，E-mail: shiningstar2013@sina.cn。