玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤的實(shí)驗(yàn)研究

胡成棟，劉曦，李盼，周玉軍，陳懷志，郭全義

?

玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤的實(shí)驗(yàn)研究

胡成棟，劉曦，李盼，周玉軍，陳懷志，郭全義

【摘要】

目的觀察玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤的效果。

方法選取 30 只新西蘭大耳白兔，隨機(jī)分為玻璃化冷凍組、常規(guī)低溫冷凍組和新鮮髓核細(xì)胞組，每組 10 只，將取下的腰椎間盤標(biāo)本通過玻璃化冷凍法與常規(guī)低溫冷凍法分別凍存 30 d，復(fù)溫洗脫后，利用 MTT 比色法測量兩組腰椎間盤纖維環(huán)及髓核細(xì)胞的相對(duì)活性，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測其細(xì)胞存活率。

結(jié)果MTT 比色法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法所得結(jié)果基本一致，玻璃化冷凍組和常規(guī)低溫冷凍組兔腰椎間盤髓核細(xì)胞存活率和相對(duì)活性均低于新鮮髓核細(xì)胞組，玻璃化冷凍組的兔腰椎間盤髓核細(xì)胞存活率和相對(duì)活性均優(yōu)于常規(guī)低溫冷凍組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

結(jié)論玻璃化冷凍法保存兔腰椎間盤髓核細(xì)胞存活率及細(xì)胞活性高，保存效果優(yōu)于常規(guī)低溫冷凍法。

【關(guān)鍵詞】玻璃化作用；低溫保存；椎間盤

作者單位：056001 河北省邯鄲市中心醫(yī)院骨二科（胡成棟、李盼、周玉軍、陳懷志），免疫科（劉曦）；100039 北京，中國人民解放軍總醫(yī)院骨科研究所（郭全義）

www.cmbp.net.cn中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):247-251

目前臨床上經(jīng)常用傳統(tǒng)低溫冷凍法保存腰椎間盤，但該法常導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶，由于凍融效應(yīng)造成細(xì)胞損傷，腰椎間盤細(xì)胞存活率和活性下降，從而導(dǎo)致其應(yīng)用受到限制［1］。玻璃化冷凍法采用高濃度溶液單步驟快速降溫，溶液轉(zhuǎn)變?yōu)椴Ａ訜o定形體，組織在保存過程中細(xì)胞內(nèi)外不形成結(jié)晶，避免了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，有效保留了細(xì)胞的活性［2-4］。目前國內(nèi)外已成功應(yīng)用玻璃化法進(jìn)行了多種細(xì)胞的保存（如卵母細(xì)胞、精子、成骨細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等），對(duì)組織玻璃化保存的研究也逐漸完善（如皮膚、胰腺、神經(jīng)、血管、角膜、心臟瓣膜、腎臟、軟骨、肌腱等）。然而玻璃化法保存椎間盤的研究在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。作者在此基礎(chǔ)上，探索玻璃化法保存腰椎間盤的可行性，觀察保存效果并對(duì)玻璃化法保存兔腰椎間盤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物4 ～ 5 個(gè)月齡新西蘭大白兔30 只，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，動(dòng)物編號(hào)：1412033，雌雄各半，重量為 2.5 ～3.0 kg。實(shí)驗(yàn)于 2013 年 4 月 - 2014 年 4 月在河北省邯鄲市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1.2儀器及試劑WKL 型微機(jī)程控降溫儀為北京歐科利技術(shù)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；MDF-C2156VANX 型深低溫冰箱為日本 Sanyo 公司產(chǎn)品；D1008 型液氮保存罐為美國 Scilogex 公司產(chǎn)品；M-W-0081 型顯微手術(shù)器械為北京中興名業(yè)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；BX51 型手術(shù)顯微鏡為日本 Olympus 公司產(chǎn)品。二甲基亞砜、乙酰胺、蔗糖均購自北京化學(xué)試劑有限公司；0.25% 胰蛋白酶、0.2% II 型膠原酶均購自德國 Serva 公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組隨機(jī)分為玻璃化冷凍組（實(shí)驗(yàn)組），常規(guī)低溫冷凍組（對(duì)照組），新鮮髓核細(xì)胞組（空白對(duì)照組），每組 10 只。安樂死后無菌條件下切取兔腰 1 至骶 1 共 5 個(gè)椎間盤組織，去除纖維環(huán)及交界區(qū)組織，將分離出的髓核組織用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2常規(guī)低溫冷凍組保存方法將腰椎間盤髓核組織樣本由常溫狀態(tài)浸入主要由 2.0 mmol/L 二甲基亞砜組成的 4 ℃ 冷凍液，利用微機(jī)程控降溫儀以 5 ℃/min 速率逐漸降溫至 -80 ℃，深低溫平衡 30 min，迅速投入液氮中保存。5、10、15、20、30 d 后分別將樣本取出，37 ℃ 水浴復(fù)溫（速率約100 ℃/min）30 s，用蔗糖 D-Hank′s 平衡液洗脫。

1.2.3玻璃化冷凍保存方法以二甲基亞砜和乙酰胺為基礎(chǔ)液，DMEM-F-12 細(xì)胞培養(yǎng)液為溶劑配制成二甲基亞砜和乙酰胺濃度均為 3.5 mmol/L 的玻璃化溶液，將樣本在 4 ℃ 經(jīng) 3 個(gè)濃度梯度（25%、50%、75%）玻璃化溶液浸泡平衡處理，每濃度梯度平衡 15 min，轉(zhuǎn)入 100% 玻璃化溶液中平衡 30 min，然后迅速投入液氮中保存。5、10、15、20、30 d 后分別取出樣本，37 ℃ 水浴復(fù)溫（速率約 100 ℃/min）30 s 后，經(jīng) 3 個(gè)濃度梯度（75%、50%、25%）的玻璃化溶液洗脫后再用蔗糖D-Hank′s 平衡液洗脫。

1.2.4細(xì)胞收集將兩種方法保存的腰椎間盤髓核樣本用 PBS 溶液涮洗 3 遍后移至盛有濃度為0.2% 的 II 型膠原酶中，剪碎為 1 mm3的組織塊，放入磁力轉(zhuǎn)子在 37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中消化 40 min。消化后的混懸液以 1700 r/min 離心5 min，棄上清液后加入 0.25% 胰蛋白酶，再次放入培養(yǎng)箱中消化 20 min，加入含 10% 血清的DMEM-F-12 培養(yǎng)液停止消化，離心棄上清液后將原代細(xì)胞以 3 × 104個(gè)/cm2密度接種于 96 孔培養(yǎng)板中。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1MTT 比色法檢測細(xì)胞相對(duì)活性將原代細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板后，將其置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h 后首次換液，之后隔天換液，當(dāng)細(xì)胞生長到 80% ～ 90% 融合時(shí)，在培養(yǎng)板的各孔中加入 20 μl MTT 溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入 150 μl 二甲基亞砜，振蕩 10 min 以使晶體溶解充分。在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔在波長為 490 nm 處的吸光度值。

1.3.2臺(tái)盼藍(lán)法檢測細(xì)胞存活率取髓核原代細(xì)胞懸液 0.5 ml 加入 20 ml 試管中，加入 0.5 ml 0.4% 臺(tái)盼藍(lán)染液染色 2 ～ 3 min，吸取適量懸液涂于載玻片上，加上蓋玻片。利用血球計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)藍(lán)染的死細(xì)胞及不染色的活細(xì)胞，計(jì)算髓核細(xì)胞存活率。計(jì)算公式為：回收率（%）=（洗脫后的細(xì)胞數(shù)/凍存前的細(xì)胞數(shù)）× 100%；存活率（%）=（洗脫后的細(xì)胞數(shù)/洗脫前的細(xì)胞數(shù)）× 100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理，計(jì)量資料采用±s 表示，組間差異采用 t 檢驗(yàn)，以 P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兔腰椎間盤組織取材后情況

兔腰椎間盤縱軸長為（1.2 ± 0.11）cm，橫軸長（0.5 ± 0.06）cm（圖1），椎間盤取材后需要立即用注射器抽取生理鹽水反復(fù)沖洗終板，以防止血液凝固后影響凍存試劑的滲透，影響凍存效果。

圖1　取材后的兔椎間盤組織Figure 1　The rabbit intervertebral disc after operation

2.2MTT 比色法檢測髓核細(xì)胞相對(duì)活性

實(shí)驗(yàn)中用酶聯(lián)免疫檢測儀在 490 nm 波長處測定 96 孔板中各組的吸光值，可間接測量活細(xì)胞數(shù)量，玻璃化冷凍組和常規(guī)低溫冷凍組兔腰椎間盤髓核細(xì)胞相對(duì)活性均低于新鮮髓核細(xì)胞組，而玻璃化冷凍組髓核細(xì)胞相對(duì)活性高于常規(guī)低溫冷凍組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），隨著凍存時(shí)間的延長，常規(guī)低溫冷凍組髓核細(xì)胞相對(duì)活性逐漸下降，而玻璃化冷凍組髓核細(xì)胞活性基本不變（圖2）。

圖2　MTT 比色法檢測兩組兔腰椎間盤髓核細(xì)胞相對(duì)活性Figure 2　Relative activity of rabbit lumbar nucleus pulposus cells was tested by MTT assay

2.3臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測髓核細(xì)胞存活率

所有兔髓核細(xì)胞中，死細(xì)胞可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，活細(xì)胞拒染。顯微鏡下計(jì)數(shù)藍(lán)染的死細(xì)胞及未著色的活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)分析后得出玻璃化冷凍組兔腰椎間盤髓核細(xì)胞存活率均低于新鮮髓核細(xì)胞組，而玻璃化冷凍組髓核細(xì)胞存活率高于常規(guī)低溫冷凍組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05），隨著凍存時(shí)間延長，常規(guī)低溫冷凍組髓核細(xì)胞存活率逐漸下降，而玻璃化冷凍組髓核細(xì)胞存活率基本不變（圖3），臺(tái)盼藍(lán)拒染法和 MTT 比色法所測得結(jié)果基本一致。

圖3　臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測兔腰椎間盤髓核細(xì)胞存活率Figure 3　The viability of rabbit lumbar nucleus pulposus cells was tested by typan blue assay

3　討論

腰椎間盤位于兩個(gè)椎體之間，由周圍纖維環(huán)、中心髓核和上下軟骨終板三部分構(gòu)成。目前臨床上腰椎間盤退變導(dǎo)致腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄、退變性腰椎滑脫、節(jié)段性腰椎不穩(wěn)定等疾病逐漸增多，嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量［5］。現(xiàn)在，治療嚴(yán)重椎間盤退行性病變常用的治療方法為椎體融合，但是椎體融合后限制相應(yīng)節(jié)段脊柱的活動(dòng)，使鄰近節(jié)段脊柱活動(dòng)增加，從而加速了鄰近節(jié)段椎間盤退變［6］，人工椎間盤置換可保留相應(yīng)節(jié)段脊柱的運(yùn)動(dòng)，但是其可使脊柱運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生永久性改變，可導(dǎo)致相鄰節(jié)段椎體壓力增加以及不穩(wěn)，同樣可加速鄰近節(jié)段椎間盤退變［7］，并且存在假體松動(dòng)，下沉，磨損，自發(fā)融合等一系列問題［8］。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，同種異體腰椎間盤移植成為治療腰椎間盤退變的一個(gè)理想方法，阮迪克等研究同種異體椎間盤移植系列動(dòng)物試驗(yàn)及臨床手術(shù)，初步應(yīng)用均取得了滿意效果，并對(duì)多名椎間盤移植治療的患者進(jìn)行 5 年隨訪，隨訪結(jié)果也非常滿意［9-10］。然而，由于同種異體椎間盤的供體少、保存時(shí)間、尺寸匹配、傳染性疾病等原因嚴(yán)重限制了其在臨床上的推廣與應(yīng)用。因此，研究椎間盤的長期保存方法，將有助于建立椎間盤組織庫，進(jìn)而可促進(jìn)同種異體椎間盤移植治療方法在臨床上的開展。目前，保存椎間盤常采用慢速冷凍法，該法易使椎間盤細(xì)胞內(nèi)外形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)膜及細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷，復(fù)溫后椎間盤細(xì)胞存活率和活性下降，且其操作復(fù)雜繁瑣，導(dǎo)致其在椎間盤移植中的應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)旨在探討玻璃化冷凍保存腰椎間盤的可行性，并分析其保存效果，為椎間盤移植技術(shù)的應(yīng)用提供理想的組織保存方法。玻璃化保存方法已成功用于胚胎、肌腱、胰島、組織工程骨、關(guān)節(jié)軟骨等多種組織的保存，并取得了理想的效果，但采用此方法保存腰椎間盤尚未見報(bào)道。

玻璃化法指采用高濃度溶液單步驟快速降溫，使物質(zhì)由液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻橛谝簯B(tài)和固態(tài)之間的非結(jié)晶高黏稠狀態(tài)（玻璃樣無定形體），冷凍過程無相變，物質(zhì)連續(xù)固化形成玻璃態(tài)，細(xì)胞內(nèi)外不形成結(jié)晶或僅少量結(jié)晶，玻璃態(tài)物質(zhì)的分子間關(guān)系與液態(tài)相比無明顯改變，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞活性得到了較好保存［4， 11-12］。玻璃化溶液常由滲透性低溫保護(hù)劑、小分子糖類、高分子聚合物 3 種成分組成。常用的滲透性低溫保護(hù)劑為二甲基亞砜。高分子聚合物包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖、葡聚糖等，可通過降低細(xì)胞外所需的滲透性低溫保護(hù)劑的濃度來減輕對(duì)細(xì)胞的毒性［13］。小分子糖類如葡萄糖、蔗糖等，無細(xì)胞毒性，但有較強(qiáng)的滲透效應(yīng)，可以使細(xì)胞脫水，從而降低細(xì)胞內(nèi)滲透性低溫保護(hù)劑的濃度，減輕細(xì)胞腫脹［14］。玻璃化法比傳統(tǒng)的低溫冷凍法所用的冷凍保護(hù)劑濃度大很多，冷凍保護(hù)劑的濃度越高，毒性也就越大。本試驗(yàn)對(duì)冷凍保護(hù)劑進(jìn)行了合理配置，兼顧強(qiáng)穿透性和強(qiáng)玻璃化能力，又降低了保護(hù)劑的毒性，使其玻璃化效果達(dá)到了最好。我們選擇了低毒性的冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜，并且在玻璃化冷凍開始之前應(yīng)用四步平衡法從低濃度向高濃度建立滲透梯度，使冷凍保護(hù)劑均勻緩慢地滲入細(xì)胞，嚴(yán)格控制每個(gè)步驟的平衡時(shí)間，使細(xì)胞內(nèi)的溶液濃度達(dá)到玻璃化的要求。復(fù)溫后采用蔗糖 D-Hank′s 平衡液代替等滲溶液對(duì)椎間盤髓核組織進(jìn)行洗脫，這樣既可防止水分子快速滲入細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞崩解，又可加速冷凍保護(hù)劑從細(xì)胞內(nèi)排出，減輕保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的毒性損傷。

MTT 比色法和臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測髓核細(xì)胞相對(duì)活性和細(xì)胞存活率，玻璃化冷凍組和常規(guī)低溫冷凍組兔腰椎間盤髓核細(xì)胞相對(duì)活性和細(xì)胞存活率均低于新鮮髓核細(xì)胞組，而玻璃化冷凍組髓核細(xì)胞相對(duì)活性和細(xì)胞存活率高于常規(guī)低溫冷凍組，隨著凍存時(shí)間的延長，常規(guī)低溫冷凍組髓核細(xì)胞相對(duì)活性和細(xì)胞存活率逐漸下降，而玻璃化冷凍組基本不變。由此我們可以得知，玻璃化法凍存兔椎間盤組織過程中細(xì)胞存活率和相對(duì)活性不隨凍存時(shí)間延長而下降，凍存效果優(yōu)于常規(guī)低溫冷凍法，凍存效果比較理想，可用于長期保存組織、細(xì)胞或器官，但是移植效果需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。尋找對(duì)兔腰椎間盤組織和細(xì)胞毒性較小的玻璃化溶液配比方案和優(yōu)化腰椎間盤玻璃化低溫保存程序，并觀察玻璃化保存后的移植效果是本研究下一步的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

［1］ Chan SC， Lam S， Leung VY， et al. Minimizing cryopreservationinduced loss of disc cell activity for storage of whole intervertebral discs. Eur Cell Mater， 2010， 19：273-283.

［2］ Brockbank KG， Chen Z， Greene ED， et al. Vitrification of heart valve tissues. Methods Mol Biol， 2015， 1257：399-421.

［3］ Marco-Jiménez F， Garcia-Dominguez X， Jimenez-Trigos E， et al. Vitrification of kidney precursors as a new source for organ transplantation. Cryobiology， 2015， 70（3）：278-282.

［4］ Maehara M， Sato M， Watanabe M， et al. Development of a novel vitrification method for chondrocyte sheets. BMC Biotechnol， 2013，13：58.

［5］ Kim SH， Kuh SU， Kim KN， et al. Biologic response of degenerative living human nucleus pulposus cells to treatment with cytokines. Yonsei Med J， 2015， 56（1）：277-286.

［6］ Lam SK， Chan SC， Leung VY， et al. The role of cryopreservation in the biomechanical properties of the intervertebral disc. Eur Cell Mater，2011， 22：393-402.

［7］ Lee CK， VK Goel. Artificial disc prosthesis： design concepts and criteria. Spine J， 2004， 4（6 Suppl）：209S-218S.

［8］ Dong L， Tan MS， Yan QH， et al. Footprint mismatch of cervical disc prostheses with Chinese cervical anatomic dimensions. Chin Med J （Engl）， 2015， 128（2）：197-202.

［9］ Luk KD， Ruan DK. Intervertebral disc transplantation： a biological approach to motion preservation. Eur Spine J， 2008， 17 Suppl 4：504-510.

［10］ Ruan D， He Q， Ding Y， et al. Intervertebral disc transplantation in the treatment of degenerative spine disease： a preliminary study. Lancet，2007， 369（9566）：993-999.

［11］ Pyne DG， Liu J， Abdelgawad M， et al. Digital microfluidic processing of mammalian embryos for vitrification. PLoS One， 2014， 9（9）：e108128.

［12］ De Munck N， Petrussa L， Verheyen G， et al. Chromosomal meiotic segregation， embryonic developmental kinetics and DNA （hydroxy）methylation analysis consolidate the safety of human oocyte vitrification. Mol Hum Reprod， 2015， 21（6）：535-544.

［13］ Kuleshova LL， Shaw JM， Trounson AO. Studies on replacing most of the penetrating cryoprotectant by polymers for embryo cryopreservation. Cryobiology， 2001， 43（1）：21-31.

［14］ Magalh?es R， Wang XW， Gouk SS， et al. Vitrification successfully preserves hepatocyte spheroids. Cell Transplant， 2008， 17（7）：813-828.

ObjectivesTo observe the effect of preservation of the rabbit intervertebral disc by vitrification.

MethodsThirty New Zealand white rabbits were randomly divided into vitrification preservation group， cryopreservation group and fresh nucleus pulposus cells group， with ten rabbits in each group. The specimens of the lumbar intervertebral disc were frozen by vitrification or cryopreservation respectively for 30 d. Then， the complex was removed from storage and rapidly thawed in a 37 ℃shaking water bath. MTT colorimetric method was used to measure the relative activity of two groups of lumbar intervertebral disc annulus and nucleus pulposus cells， and cell survival rate was detected by using the method of the trypan blue dye exclusion assay.

ResultsThe final results of MTT colorimetric method were basically in agreement with the results of trypan blue dye exclusion assay. The survival rate and relative activity of the rabbit lumbar disc nucleus pulposus cells in the vitrification preservation group and cryopreservation group were less than those in the fresh nucleus pulposus cells group. The survival rate and relative activity of the rabbit lumbar disc nucleus pulposus cells in the vitrification preservation group were better than those in the cryopreservation group， and the difference was statistically significant （P ＜ 0.05）.

ConclusionThe intervertebral disc preserved by vitrification had higher survival rate and better activity than the cryopreservation group.

【Key words】 Vitrification；Cryopreservation；Intervertebral disc

Author Affiliations: The Second Department of Orthopedics （HU Cheng-dong， LI Pan， ZHOU Yu-jun， CHEN Huai-zhi），Department of Rheumatology （LIU Xi）， Handan Central Hospital， Hebei 056001， China； Institute of Orthopedics， Chinese PLA General Hospital， Beijing 100039， China （GUO Quan-yi）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):247-251

An experimental study on the vitrification preservation of rabbit intervertebral disc

HU Cheng-dong， LIU Xi， LI Pan， ZHOU Yu-jun， CHEN Huai-zhi， GUO Quan-yi

【Abstract】

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.009

基金項(xiàng)目：河北省邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（0928108052）

通信作者：胡成棟，Email：hcd111111@163.com

收稿日期：2015-12-18

Corresponding Author:HU Cheng-dong， Email： hcd111111@163.com