一種野生羊肚菌的鑒定與不同部位菌絲分離保藏*

劉　東　趙　敏

（東北林業大學生命科學學院，黑龍江　哈爾濱　150040）

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一種野生羊肚菌的鑒定與不同部位菌絲分離保藏*

劉東趙敏**

（東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150040）

摘要：通過提取野生羊肚菌屬真菌子實體總DNA，并對其ITS序列進行擴增、測序和分析鑒定的結果表明：該菌株為尖頂羊肚菌；通過對晾干后子實體不同組織部位（菌頂、菌柄、子實體根部）菌絲ITS序列的分析證明：從菌頂和菌柄分離得到的菌絲序列與子實體一致，但從子實體根部分離得到的菌絲為海綿共附生真菌；其中菌柄組織的菌絲成活率最高，且組織萌發最快，更容易得到菌絲。

關鍵詞：食用菌；分離；鑒定；ITS

*國家林業局948項目（2012-4-03）資助

近年來羊肚菌屬真菌（Morchella conica）被作為營養保健食品而倍受人們的青睞，致使其被過度采摘。鑒于羊肚菌子實體存在組織脆嫩、極易染菌而腐爛變質的問題，對該菌種質資源的分離和保藏迫在眉睫［1-3］。本研究利用簡便、快速、客觀的ITS序列分析方法對晾干后的野生羊肚菌屬真菌子實體進行鑒定［4-5］，同時對晾干后子實體的不同組織部位（菌頂、菌柄、子實體根部）進行菌絲分離并鑒定，從而為菌種的準確嚴謹保藏，以及完善野生食用菌的分離和保藏提供了科學的方法。

1材料與方法

1.1試驗材料

野生菌于2014年5月采自遼寧省寬甸縣石湖溝村山丘上的灌木林中，晾干待用。通過形態學初步鑒定該野生食用菌為羊肚菌屬真菌。

1.2試驗方法

1.2.1菌體總DNA提取

參照改進CTAB法［6］提取子實體的總DNA，用1％的瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品的質量和濃度。

1.2.2 ITS基因擴增及純化

PCR反應引物：采用ITS序列的通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG；ITS4：TCCTC CGCTTATTGATATGC。

50 μL反應體系：引物各2 μL；模板1 μL；20 Mm/LdNTP 4 μL；10×PCR buffer 5 μL；5 U/μL TaqDNA聚合酶（全式金）0.2 μL；ddH2O 35.8 μL。

反應條件：94℃4 min；94℃30s，54℃30s，72℃1 min，30個循環；72℃10 min。用1％的瓊脂糖凝膠以DL2 000為marker，對PCR產物進行電泳檢測。

1.2.3序列測定

采用PCR產物克隆測序，將PCR產物純化，與pEASY-T1 Cloning Vector連接后轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞中，用含有Amp的LB平板進行菌落篩選培養，PCR檢測。克隆成功后，菌液委托北京金唯智生物科技公司雙向測序。

1.2.4組織分離及分離菌絲的ITS序列鑒定

分離培養基選用武冬梅的PDA固體分離培養基［7］，將晾干的野生食用菌子實體放入已滅菌的超凈工作臺上，用柳葉刀對子實體的菌頂、菌柄和子實體根部進行分離。然后將切好的組織小塊依次放入70％乙醇30s、0.1％HgCl 30s、70％乙醇30s、無菌水30s滅菌。處理后放入無菌水中，再將其分別接種于PDA固體培養基中，在27℃恒溫培養箱中培養，觀察記錄菌絲狀態及成活率。每個處理重復9次，并將不同組織部位分離得到的菌絲轉接到固體PDA斜面培養基上進行菌種保藏。同時將不同組織部位分離獲得的菌絲，轉接到液體PDA培養基中，在27℃，140 rpm條件下進行培養，液體培養5～6天后，分離菌體，參照上面改進CTAB法提取子分離菌絲的總DNA，利用上述ITS鑒定方法對不同組織部位分離菌絲進行測序鑒定。

2結果與分析

2.1野生食用菌子實體ITS序列測序結果比對

將野生食用菌子實體ITS序列提交NCBI進行Blast比對分析，其中登錄號為EF080999的序列與野生食用菌ITS序列相似度為92％，經查閱文獻確定此菌株為尖頂羊肚菌（Morchella conica）。

2.2分離部位對菌絲成活的影響

由野生食用菌不同分離部位的菌絲成活及生長狀態（表1）可知：子實體菌柄分離得到的菌絲萌發最快，其次為子實體根部，菌頂處最差；菌絲萌發率最高的為菌柄部分，其次為子實體菌根；從菌頂與菌柄分離得到的菌絲均為黃白色絨毛狀，而子實體根部則為灰白色絨絮狀菌絲。液體培養中，菌柄分離得到的菌絲生長最快且均勻，菌頂分離得到菌絲生長較慢。

表1　野生食用菌不同分離部位的菌絲成活和菌絲生長狀態

2.3野生食用菌ITS基因擴增結果分析

由野生食用菌和不同部位分離得到菌絲的ITS片段PCR產物電泳圖（圖1）可以看出：所有樣品的ITS序列擴增產物均獲得明亮單一條帶，且分子量在750 bp左右，符合ITS序列的長度，可用于進一步測序分析。

2.4測序結果比對與分析

將菌頂、菌柄和子實體菌根分離得到的菌絲擴增ITS序列，即X1、X2、X3序列交NCBI進行Blast比對分析（表2），其中菌頂和菌柄序列比對結果與子實體序列結果一致，均為尖頂羊肚菌（Morchella conica.），子實體根部所獲得的菌絲則為海綿共附生真菌。

圖1　野生食用菌和不同部位分離獲得菌絲的ITS片段PCR產物電泳圖注：M為Marker DL2000；X為野生食用菌子實體擴增ITS片段；X1、X2、X3為菌頂、菌柄和子實體根部分離所得菌絲擴增ITS片段

表2　野生食用菌不同分離部位對菌絲生長狀態的影響和分子鑒定結果比對

3結論

3.1利用簡單、快捷的ITS序列對未知野生食用菌進行鑒定得到，該野生食用菌為尖頂羊肚菌（Morchella conica）。

3.2利用不同組織部位分離方法對晾干的野生食用菌子實體進行菌絲分離，結果表明：菌頂和菌柄的萌發率分別為20％、50％，染菌率很低，菌絲狀態為黃白色絨毛狀；而子實體根部雖然萌發率高達40％，染菌率卻很高，菌絲狀態為灰白色絨絮狀。

3.3通過對所獲得的菌絲進行液體培養和ITS序列擴增分析表明，菌頂和菌柄分離得到的菌絲為尖頂羊肚菌（Morchella conica），子實體菌根則為其他共生雜菌，說明在菌絲分離過程中對分離菌絲進行分子鑒定是必要的。

3.4不易保存的野生真菌可以通過簡單的晾干后再對子實體進行分離也可以得到萌發菌絲，通過分子鑒定方法進一步鑒定能更準確的獲得正確菌絲，這為以后野生食用菌種質資源的鑒定與分離保藏提供重要的參考，使菌種質資源的保藏更加系統化。

參考文獻

［1］趙琪，康平德，戚淑威，等.羊肚菌資源現狀及可持續利用對策［J］.西南農業學報，2010（1）：266-269.

［2］楊槐俊，郭素萍，尤利霞，等.山西特殊名優真菌分離培養及原生態擴繁［A］.中國菌物學會、中國農學會食用菌分會.第九屆全國食用菌學術研討會摘要集［C］.中國菌物學會、中國農學會食用菌分會，2010：1.

［3］付紹春，譚琦，尚曉冬，等.野生食用菌種質資源采集過程中應注意的幾個問題［A］.中國菌物學會、中國農學會食用菌分會.第九屆全國食用菌學術研討會摘要集［C］.中國菌物學會、中國農學會食用菌分會，2010：1.

［4］羅曉莉，朱立，張微思，等.野生食用菌保鮮技術研究概況及發展趨勢［J］.食品研究與開發，2012（2）：200-202.

［5］燕勇，李衛平，高雯潔，等.rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應用［J］.中國衛生檢驗雜志，2008（10）：1958-1961.

［6］吳發紅，黃東益，黃小龍，等.幾種真菌DNA提取方法的比較［J］.中國農學通報，2009（8）：62-64.

［7］武冬梅，許文濤，謝宗銘，李全勝，羅云波.新疆伊犁昭蘇野生羊肚菌分離株的分子鑒定研究［J］.北方園藝，2014 （21）：145-148.

（責任編輯：李丹）

Separation and Preservation of Different Parts of a Morchella esculenta and Its Identification

LIUDong
（College of Life Sciences，Northeast Forestry University，Heilongjiang Harbin 150040）

AbstractGenomic DNA was extracted from fruiting body then used as template for the ITS gene PCR amplification.Different air-dried fruit body parts of the wild edible mushroom（pileus，stipe，fruiting body root）was isolate and identify.The results show that，it was Morchella conica（EF080999）by the rDNA ITS sequence analysis.“PCR”should be revised to“Sequencing”analysis showed that the separated mycelium of pileus and stipe which came from the wild fungus's fruiting body.But the separated mycelium of fruiting body root is Hansfordia sp.；The survival rate of organization of the stipe was the highest and the stipe germinated was the fastest.

Key wordsEdible fungi；Isolation；Identification；ITS

中圖分類號：S567.3+9

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9499（2016）03-0027-03

作者簡介：第1劉東（1988-），男，碩士，主要從事大型真菌鑒定和漆酶分子生物學及其降解污染物等研究工作。

通訊作者：趙敏（1964-），男，博士，教授，主要從事污染物降解微生物、漆酶分子生物學及其降解污染物等研究工作。

收稿日期：2016-03-11