威寧綿羊和貴州半細毛羊FecB基因SNP分析

王 振，申小云，盤道興，謝海強，劉若余

（1.貴州大學動物科學學院/貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省扶貧辦公室外資項目管理中心，貴州 貴陽 550004；3.西南科技大學生命科學院，四川 綿陽 621010）

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威寧綿羊和貴州半細毛羊FecB基因SNP分析

王 振1，申小云2，3，盤道興1，謝海強1，劉若余1

（1.貴州大學動物科學學院/貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州省扶貧辦公室外資項目管理中心，貴州 貴陽 550004；3.西南科技大學生命科學院，四川 綿陽 621010）

摘 要：利用威寧綿羊和貴州半細毛羊構建DNA池，設計11對引物擴增其FecB基因外顯子和部分內含子的序列，對純化后的PCR產物雙向測序，分析確定多態性位點。然后利用生物信息學軟件分析SNPs位點對FecB基因RNA二級結構、FecB蛋白結構的影響。結果顯示，在擴增的FecB基因中篩選到10個SNPs，其中exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 突變為威寧綿羊和貴州半細毛羊中所共有，而exon9-A8G和intron1-G243A 突變為威寧綿羊所特有，intron3-G177A和exon8-T86C 突變為貴州半細毛羊所特有。上述的SNPs中，exon5-A39G 和exon9-A8G為錯義突變，exon5-A39G突變導致編碼的異亮氨酸（Ile）變為纈氨酸（Val），exon9-A8G突變導致編碼的天冬酰胺（Asn）變為天冬氨酸（Asp）； exon9-C37A和exon11-C87A多態位點均未改變氨基酸的編碼，為同義突變。

關鍵詞：FecB基因；威寧綿羊；貴州半細毛羊；單核苷酸多態性（SNP）

威寧綿羊主產于貴州省威寧縣，為粗毛羊，體質結實，特別能適應貴州威寧等海拔較高的山區養殖，但其個體較小，生長速度十分緩慢，繁殖率低，產單羔。因此，提高威寧綿羊的繁殖率育種工作具有重要意義。

貴州半細毛羊是20世紀80年代畢節市牧科所參與培育出的第1個綿羊品種，由新疆細毛公羊與貴州本地粗毛母羊雜交組合，將雜交二代母羊考力代公羊作級進雜交，育成考細雜羊，進而在考細雜和部分羅細雜、羅考細雜組合的后代中選擇理想型公母羊橫交固定，最終育成達到育種目標的貴州半細毛羊。貴州半細毛羊繁殖率低，因此有必要對貴州半細毛羊作進一步培育，提高其繁殖率，使其成為同時符合肉用市場和毛用市場需求的毛肉兼用型貴州半細毛羊品種［1］。

FecB基因是Davis［2］在20世紀80年代從布魯拉美利奴（Booroola Merino）綿羊中發現的。當時，Davis認為該基因有可能是增加布魯拉美利奴綿羊排卵數和產羔數的一個染色體突變基因。在綿羊的高繁殖力的主效基因中，FecB基因是第1個被識別出的。該基因在1989年被綿、山羊遺傳命名委員會正式命名為FecB基因［3］。Lord 等［4］利用微衛星BM1329和OarAE101作標記對FecB基因進行研究，發現FecB基因位于6號染色體的BM1329和OarAE101之間10 cM連鎖群中。

FecB 基因對綿羊的的生理有多方面的影響，其中最為顯著的生理作用體現在對卵巢排卵卵泡數量和大小的影響。有研究發現，不攜帶 FecB基因的野生型母羊成熟并排卵的卵泡直徑都顯著大于攜帶有FecB基因的母羊（基因純合和基因雜合）［5］，并且不攜帶FecB基因的野生型母羊小卵泡所含有的顆粒細胞比攜帶FecB基因純合的母羊多得多。Wilson等［6］發現，FecB基因第7外顯子發生1處突變（A746G），突變導致了第249位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突變為精氨酸（Arg），造成布魯拉美利奴綿羊排卵數明顯增加。李達等［7］利用PCR－SSCP以及PCR－RFLP方法對湖羊、小尾寒羊、阿勒泰羊、洼地綿羊的FecB基因進行SNP分析，研究結果顯示，上述4個綿羊品種均攜帶FecB突變，且能證明FecB 基因為洼地綿羊高繁殖力的主效基因。

本試驗構建威寧綿羊、貴州半細毛羊進行DNA池［8］，對FecB基因的SNP多態性位點進行篩選，并作生物信息學分析，估算基因頻率，探究SNP位點對RNA二級結構、蛋白質結構的影響，為研究該基因對綿羊生產性能的影響奠定基礎，同時還為威寧綿羊和貴州半細毛羊的選種選育工作提供依據。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

威寧綿羊血樣61個由威寧縣畜禽品種改良站提供；貴州半細毛羊血樣60個采自貴州省畢節市威寧縣威寧種羊場。Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（血液）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與DNA池構建 本試驗采用血液Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒提取威寧綿羊和貴州半細毛羊血樣的DNA，綿羊血樣DNA基因組的提取效果通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢驗，DNA濃度則利用紫外分光光度計進行檢測，并將DNA基因組的濃度分別調整到100 ng/μL。然后分別將威寧綿羊和貴州半細毛羊的DNA樣品每個各取5μL混合，構建兩個DNA池。

1.2.2 引物設計和DNA擴增 通過NCBI數據庫查找綿羊FecB基因的DNA序列（GenBank登錄號：NC_019463.1），再利用NCBI的在線軟件Primer-BLAST設計11對特異性引物。各對特異性引物對應的最適退火溫度見表1。PCR擴增采用鼎國生物公司生產的Mix，反應體系總體積為30μL，將擴增的PCR產物利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，再運用凝膠成像儀對試驗的凝膠電泳結果進行拍照，并觀察各對特異性引物PCR擴增的效果。

表1　引物序列、退火溫度及目的片段長度

1.2.3 序列分析 PCR產物純化后由北京諾薩基因公司對其進行雙向測序，運用DNAstar軟件對測序結果進行校正對比，再通過BLAST軟件分析確定單核苷酸多態性。

1.2.4 測序圖峰高測量及等位基因頻率估算 試驗所測得結果圖峰采用MWSnap軟件測量等位基因對應的峰高，再根據公式Ai=Bi/（B1+B2），估算等位基因頻率［9］。式中i=1，2，Ai表示SNP位點等位基因頻率，B1和B2分別表示測序結果上該SNP等位基因1、2相對應的峰高。

1.2.5 FecB的RNA二級結構預測及蛋白結構分析 利用http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi在線軟對RNA的二級結構進行預測；通過https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.htm l在線軟件對蛋白質的二級結構進行預測；通過http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/htm l/page.cgi？id=index在線軟件對蛋白質的三級結構進行預測。

2　結果與分析

2.1 DNA池的PCR產物測序

圖1　PCR擴增電泳結果

運用PCR技術擴增出威寧綿羊和貴州半細毛羊的FecB基因的部分序列（圖1）。將擴增產物常規純化，然后進行雙向測序。利用BLAST軟件分析測序結果，共發現10個SNPs（圖2），以各個外顯子第1位堿基數分別為1，SNPs分別為：exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 、exon9-A8G、intron1-G243A、intron3-G177A和exon8-T86C。上述的SNPs中exon5-A39G 和exon9-A8G為錯義突變，exon5-A39G突變導致編碼的異亮氨酸（Ile）變為纈氨酸（Val），exon9-A8G突變導致編碼的天冬酰胺（Asn）變為天冬氨酸（Asp）；exon9-C37A和exon11-C87A多態位點均未改變氨基酸的編碼，為同義突變；intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A、intron1-G243A和intron3-G177A均在內含子區，不參與氨基酸編碼。

2.2 SNPs等位基因頻率估算

運用MWSnap軟件測量威寧綿羊和貴州半細毛羊等位基因峰的高度，估算等位基因的頻率。從表2可以看出，除exon11-C87A位點兩種綿羊差異較小外，不同綿羊品種同一突變位點和不同突變位點突變頻率相差較大。

2.3 FecB的RNA二級結構分析

預測各SNP突變位點突變前和突變后FecB基因的RNA二級結構，通過預測結果可以看出，突變引起RNA二級結構的自由能發生變化，突變前最小自由能為-2564.92 kJ/mol，突變后exon5-A39G、exon8-T86C、exon9-A8G、exon9-C37A、exon11-C87A最小自由能分別為-2630.02、-2169.11、-2593.91、-2502.16、-2505.67 kJ/mol。 RNA的二級結構及最小自由能的變化可能會使其穩定性受到影響，進一步影響蛋白質的翻譯過程。

2.4 FecB蛋白二級分析

通過在線軟件分析預測威寧綿羊和貴州半細毛羊FecB蛋白質二級結構突變前后的變化。結果表明，exon5-A39G在突變前后β轉角、α螺旋、自由卷曲和延伸鏈均沒有發生變化，而exon9-A8G在突變前后α螺旋、β轉角和延伸鏈發生了變化，自由卷曲則沒有發生變化（表3）。

2.5 突變前后FecB蛋白三級結構分析

預測突變前后蛋白質的三級結構對分析蛋白質的功能具有重要的意義，利用蛋白質三級結構的在線預測軟件對FecB蛋白突變前后的三級結構進行分析，結果（圖3）表明突變后多態位點導致FecB蛋白三級結構有所改變。

圖2　PCR產物測序及BLAST分析結果

圖3　FecB蛋白質三級結構變化

表2　等位基因頻率估算結果

表3　FecB蛋白質突變前后二級結構分析結果

3　討論

FecB基因的生物學功能十分重要，對綿羊的顯著生理作用體現在對卵巢排卵卵泡數量和大小的影響，此外，FecB基因還促進綿羊排卵和發情。FecB基因對動物的生長性能具有非常大的影響。因此，對FecB基因的深入研究有助于改善威寧綿羊和貴州半細毛羊繁殖率低，個體間差異較大的現狀，同時對加快威寧綿羊和貴州半細毛羊的遺傳育種工作和提高相關產業的生產效益具有重大科學和社會經濟價值意義。

本研究在威寧綿羊和貴州半細毛羊的FecB基因中檢測得到10個SNPs位點，其中exon5-A39G、exon9-C37A、exon11-C87A、intron2-A62G、intron4-A1023G、intron10-G24A 的突變為威寧綿羊和貴州半細毛羊中所共有，而exon9-A8G和intron1-G243A 的突變為威寧綿羊所特有，intron3-G177A和exon8-T86C 的突變為貴州半細毛羊所特有。而exon5-A39G 和exon9-A8G為錯義突變，exon5-A39G突變導致編碼的異亮氨酸（Ile）變為纈氨酸（Val），exon9-A8G突變導致編碼的天冬酰胺（Asn）變為天冬氨酸（Asp）； exon9-C37A和exon11-C87A多態位點均未改變氨基酸的編碼，為同義突變。另外，在擴增的威寧綿羊和貴州半細毛羊FecB基因序列中，并未發現A746G突變。比較10個多態性位點等位基因頻率，發現除exon11-C87A位點兩種綿羊差異較小之外，不同綿羊品種同一突變位點和不同突變位點突變頻率相差較大。exon5-A39G和exon9-A8G發生錯義突變導致RNA的二級結構和自由能發生改變，最終可能會導致編碼蛋白質的三級結構發生變化，這一變化最終是否對蛋白質的功能產生影響進而影響個體的生產性能還有待進一步驗證。此多態位點對研究FecB基因對綿羊繁殖率的影響具有重要科學意義，為后續科學研究和生產實踐奠定了一定的理論基礎。

參考文獻：

［1］ 李麗娟，申小云.貴州半細毛羊的培育歷程與養殖現狀［J］.貴州農業科學，2010，38（11）：182-184.

［2］ Davis G H.Fecundity genes in sheep［J］.Animal Reproduction Science，2004（82-83）： 247-253.

［3］ 姜運良，吳常信.Booroola Merino綿羊多胎基因FecB的研究進展［J］.中國畜牧雜志，1999，35（4）：51-53.

［4］ Lord E A，Lumsden J M，Dodds K G，et al.The linkage map of sheep chromosome 6 compared with orthologous regions in otherspecies［J］.Mammalian Genome，1996（7）： 373-376.

［5］ 鐘秀全，史萬玉，宮新城，等.黃芩白術與PXF對LPS誘導流產小鼠的保胎作用及子宮內IL-10含量的變化研究［J］.畜牧獸醫學報，2005，36（ 5）：517-520.

［6］ Wilson T，Wu X Y，Juengel J L，et al.Highly prolific Booroola sheep have a mutationin the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor（ALK-6） that is expressed in both oocytes and granulose cells［J］.Biol Reprod，2001，64（4）：1225-1235.

［7］ 李達，孫偉.綿羊FecB基因遺傳多樣性及其產羔數的關聯分析［J］.畜牧獸醫雜志，2012，31（2）：1-8.

［8］ Sham P，Bader J S，Craig I，et al.DNA pooling： a tool for large-scale association studies［J］.Nature Reviews Genetics，2002，3（11）： 862-871.

［9］ Su liman H B，Carraway M S，Piantadosi C.A.Postlipopolysaccharide oxidative damage of m itochond rial DNA［J］.American jou rnal of respiratory and critical care medicine，2003，167 （4）： 570-579.

（責任編輯崔建勛）

SNP analysis of FecB in Guizhou sem i-fine wool sheep and Weining sheep

WANG Zhen1，SHEN Xiao-yun2，3，PAN Dao-xing1，XIE Hai-qiang1，LIU Ruo-yu1

（1.College of Animal Sciences，Guizhou University/ Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guiyang 550025，China；2.Foreign Project Management Center of Guizhou Provincial Poverty Alleviation Office，Guiyang 550004，China；3.College of Life Science，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010，China）

Key words：FecB gene；Weining sheep；Guizhou semi-fine wool sheep；single nucleotide polymorphism（SNP）

Abstract：The DNA pond was constructed by using Weining sheep and Guizhou sem i-fine wool sheep.11 pairs of primers were designed to amplify exons and part of intron sequences of FecB gene，then the purified PC R products were bi-directional sequenced to analyze polymorphic sites.Bioinformatic software was used to analyze the influences of SNPs sites on RNA secondary structure and protein structure.The results showed that 10 SNPs were screened，of which exon5-A39G，exon9-C37A，exon11-C87A，intron2-A62G，intron4-A1023G，intron10-G24A mutations were located in both Weining sheep and Guizhou semi-fine wool sheep，however，exon9-A8G and intron1-G243A mutations were peculiar to Weining sheep，and exon8-T86C and intron3-G177A mutations were peculiar to Guizhou semi-fine wool sheep.Exon5-A39G and exon9-A8G were missense mutations in the above SNPs.The exon5-A39G mutation led to encoding isoleucine （Ile） into valine （Val） and the exon9 - A8G mutation led to encoding asparagine （Asn） into aspartic acid （Asp）.The exon9-C37A and exon11-C87A polymorphisms which were synonymous mutations did not change amino acid encoding.

中圖分類號：S813.3；Q346+.5

文獻標識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）01-0130-06

收稿日期：2015-08-27

基金項目：貴州省優秀教育人才省長專項（黔省專合字［2009］129）；國家現代農業產業技術體系（CARS-40-30）

作者簡介：王振（1991-），男，在讀碩士生，E-mail：614430446@qq.com

通訊作者：劉若余（1963-），男，博士，教授，E-mail：liury04@163.com