比較PCR-熒光探針法與其他方法對性病門診中衣原體和淋球菌檢出率的影響

吳開奇鐘 琦周平玉　樓永良*. 溫州醫科大學檢驗醫學院，檢驗醫學教育部重點實驗室（浙江溫州　505）；. 上海市第十人民醫院檢驗科； . 上海市皮膚病醫院性病科；

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比較PCR-熒光探針法與其他方法對性病門診中衣原體和淋球菌檢出率的影響

吳開奇1鐘 琦2周平玉3樓永良1*
1. 溫州醫科大學檢驗醫學院，檢驗醫學教育部重點實驗室（浙江溫州325035）；2. 上海市第十人民醫院檢驗科； 3. 上海市皮膚病醫院性病科；

摘要目的 比較PCR-熒光探針法與乳膠法（即沙眼衣原體抗原檢測法）和淋球菌培養法對性病門診就診者生殖道分泌物中沙眼衣原體和淋球菌檢出率，控討PCR-熒光探針法的優勢。方法 采集2015年3月至2015年12月上海市皮膚病醫院虬江分院性病門診就診的428位患者的生殖道分泌物，采用PCR-熒光探針法檢測分泌物中的衣原體和淋球菌，并與乳膠法和淋球菌培養法對比。結果 （1）PCR熒光探針法在衣原體的檢測中，428份標本中衣原體陽性檢出率顯著高于乳膠法（9.95% vs 4.21%）P＜0.01。（2）PCR熒光探針法在淋球菌的檢測中，428份標本中淋球菌陽性檢出率顯著高于淋球菌培養法（7.24% vs 2.80%，P＜0.01）。（3）PCR熒光探針法在性病門診的應用顯著增加衣原體和淋球菌陽性率的檢出，有助于臨床感染的早期診斷和及時治療。結論PCR-熒光探針法的敏感性顯著高于乳膠法和淋球菌培養法，適合廣泛應用于性病門診中檢測衣原體和淋球菌，有助于臨床早期診斷和治療。

關鍵詞衣原體， 沙眼；奈瑟球菌， 淋病；PCR-熒光探針法

衣原體和淋病雙球菌是引起泌尿生殖道感染的常見病原體，在女性感染患者中可以引起宮頸炎，尿道炎、盆腔炎、異位妊娠、早產及不孕，甚至可以通過垂直傳播引起嬰兒眼結膜炎和呼吸道感染等嚴重后果［1-3］；男性感染者則可以發生前列腺炎、尿道炎、附睪炎癥等不良結局［4］。研究顯示，當患者有衣原體感染而無臨床癥狀的出現時，往往感染被疏忽，而導致后續嚴重的并發癥［5］。同樣，女性淋病大多無癥狀，在臨床上也常常易被漏診，最終導致慢性盆腔綜合征等嚴重后果［6］。更棘手的是傳統的衣原體抗原檢測法敏感性較低，約為50%～70%，衣原體培養法耗時，操作復雜，對實驗人員要求高，臨床很少應用［7］；同時臨床發現女性淋病大多數無癥狀，往往會延遲就診而影響培養結果，造成對結果的誤判。這些因素均給臨床診斷和治療帶來困擾，因此早期發現病原體的存在，及時采取治療措施可以避免不孕不育等嚴重不良結局的產生。本研究主要采用了PCR-熒光探針法檢測性病門診采集的生殖道分泌物標本中衣原體和淋球菌，并與乳膠法（即沙眼衣原體抗原檢測法）及淋球菌培養法比較分析，探討熒光PCR方法在生殖道分泌物樣本中用來檢測衣原體和淋球菌的優越性，分析其對性病門診中衣原體和淋球菌陽性檢出率的影響。

材料和方法

一、研究對象

本實驗的研究對象為2015年3月份到12月份于上海市皮膚病醫院虬江路分院性病科門診就診且疑有泌尿生殖道感染的患者，所有患者在近一周內未使用抗生素。標本采集方法為將無菌拭子輕輕伸入男性尿道口內2～3 cm處或女性宮頸口內1～2 cm處捻轉數次并停留2min后取出，將拭子頭浸入無菌生理鹽水標本管中和特殊培養基中保存，待測衣原體、淋球菌等。在此期間一共采集到428位患者的尿道或宮頸分泌物，患者平均年齡（34.3±10.3）歲，范圍（5～78）歲，其中男性271名，平均年齡為（35.8±10.1）歲；女性157名，平均年齡為（31.7±9.2）歲；主要研究人群年齡段為20～40歲，占總人數的77%。

二、檢測方法

（一）PCR-熒光探針法

衣原體、淋球菌檢測的試劑由上海科華生物工程股份有限公司提供，檢測步驟一致，按照試劑盒說明書操作及熒光PCR儀器的軟件分析，得到樣本的檢測結果。PCR反應條件為樣本在50℃用UNG酶處理反應2min，93℃預變性2min，93℃變性10s，60℃退火、延伸及檢測熒光30s，共40次循環。

（二）乳膠法（即沙眼衣原體抗原檢測法）

在標本處理管中加入標本處理液A8滴，將采集樣本拭子與A液體反復擠壓混勻，再加入標本處理液B 8滴，充分混勻后取3滴至反應板加樣孔中，10～20 min后觀察結果。試劑由杭州艾博生物醫藥有限公司供應，詳細操作和步驟嚴格按照試劑說明書進行。

（三）淋球菌培養法

淋球菌培養采用Thayer-Martin 選擇性瓊脂基礎（MTM瓊脂基礎）培養基，將采集的拭子標本接種至培養基中，在5% CO2溫箱35℃培養48～72h后再進行判斷結果。

三、結果判斷

PCR-熒光探針法：陽性結果為樣本循環域值（cycle threshold， Ct）≤37，而Ct無數值或＞40的樣本為陰性結果，若37＜Ct＜40的樣本進行復測，復測結果＜40為陽性，否則為陰性。

乳膠法：10～20 min后在質控條帶和反應區均出現紅色條帶為陽性結果；只在質控區呈現紅色條帶為陰性結果；若是質控區無紅色條帶出現，試劑失效，應更換試劑重新檢測。

培養法：挑取直徑0.5～1.0 mm圓形、凸起、濕潤光滑、半透明或灰白色、邊緣呈花瓣狀的典型菌落，分別進行革蘭染色和氧化酶反應，并挑取菌落傳代待做進一步生化反應；氧化酶實驗于3～5 s內出現鮮紅色后變成黑色和革蘭染色后鏡下可見革蘭陰性腎形雙球菌，則判斷為淋球菌陽性。

四、統計學方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，不同方法陽性檢出率的比較采用x2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

結　果

一、PPCCRR-熒光探針法與乳膠法對生殖道分泌物中衣原體檢出率的比較

P C R -熒光探針法對衣原體檢測陽性率為9.35%，遠遠高于乳膠法4.21%（P＜0.01），并且分別在男性和女性中的陽性檢出率也都明顯高于乳膠法（男，9.96% vs 4.06%，P＜0.01；女，8.83% vs 4.45，P＜0.05），不同年齡群中也都高于乳膠法，見表1（＜20歲人群研究對象較少，故無意義）。

表1　PCR--熒光探針法和沙眼衣原體抗原檢測法對衣原體的檢測結果比較

二、PPCCRR-熒光探針法與淋球菌培養法對生殖道分泌物中淋球菌檢出率的比較

淋球菌PCR-熒光探針法陽性檢出率高于培養法（7.24% vs 2.80%，P＜0.01）；在男性和女性中其陽性率也顯著高于培養法（男9.96% vs 3.69%，P＜0.01；女2.55% vs 1.27%，P＞0.05），不同年齡段PCR熒光探針法陽性檢出率高。見表2（＜20歲人群研究對象較少，故無比較意義）。

三、PPCCRR熒光探針法與乳膠法及淋球菌培養法對性病門診就診者衣原體和淋球菌陽性檢出率的影響分析

428名就診者中衣原體和淋球菌兩種檢測方法的最終結果顯示，PCR 熒光探針法檢測衣原體陽性有40例（陽性率9.35%），淋球菌陽性有31例（陽性率7.24%）；而乳膠法檢測沙眼衣原體測陽性只有18例（陽性率4.21%），淋球菌培養法陽性只有12例（2.80%），這遠遠低于PCR熒光探針法；在男性和女性中同樣顯示PCR熒光探針法在衣原體和淋球菌檢測中的陽性率高；在對就診患者按年齡分布分析后發現在21～40年齡段檢查衣原體和淋球菌的人數最多，但乳膠法和淋球菌培養法的檢測陽性率均較低，遠遠低于PCR熒光探針法；＜20歲就診者人數較少，其結果無意義，見圖1。以上結果PCR熒光探針法檢測衣原體和淋球菌中有較高的靈敏度，可以提高衣原體和淋球菌陽性檢出率，有利于就診患者的早期診斷和治療，尤其是性病門診中就診患者多為生育階段人群并且部分患者無臨床癥狀表現，可以避免不孕不育嚴重后果的發生。

表2　PCR--熒光探針法和淋球菌培養法對淋球菌檢測結果的比較

討　論

衣原體、淋球菌是常見的性傳播感染的病原體，目前其感染率在世界范圍內一直居高不下并呈上升態勢［8，9］。盡管大多數男性淋球菌感染后可以出現尿頻、尿急、尿道流膿等急性癥狀，但大多數衣原體感染者及女性淋病患者感染后可以呈隱匿狀態長期潛伏或因患者無臨床癥狀或癥狀輕微，未及時就診引發多種并發癥，產生嚴重的后果［5，6］。已知，衣原體、淋球菌感染可以引起育齡期人群的不孕不育，而長期感染更是主要罪魁［3，10］，而且無癥狀的感染者同時是最危險的傳染源，給家庭和性伴的健康帶來隱患。因此，對衣原體、淋球菌的隱匿感染不容忽視，早期發現，及時治療，對切斷傳染源、預防并發癥意義重大，敏感和可靠的診斷技術是實現這一目標的前提條件。

圖11　PPCCRR熒光探針法較其他方法檢測衣原體和淋球菌的陽性率比較A：PCR熒光探針法和乳膠法檢測衣原體陽性率比較；B： PCR熒光探針法和淋球菌培養法檢測淋球菌陽性率比較

目前衣原體、淋球菌感染的確診主要依賴實驗室檢查［8］，因此可靠的實驗室結果是診斷的關鍵環節。乳膠法檢測沙眼衣原體已經被廣泛應用于臨床實驗室，方法簡便、快捷，但敏感性不夠［11］；培養法被認為是病原體檢測的“金標準”［12］，但操作復雜、耗時長，費用昂貴，淋球菌培養法在淋球菌的檢測中具有高度特異性，但該方法易受到標本采集、運送、保存等諸多因素的影響，尤其是女性感染時間較長的患者，結果可出現假陰性，而且需要48 h或更長時間才能得到結果［13］，期間患者因得不到及時治療可導致病原體的進一步傳播。PCR技術具有較高的敏感性和特異性，已有研究應用于結核桿菌、梅毒螺旋體、艾滋病毒等病原體感染的診斷和療效判斷中［14-16］。本研究中采集到我院性病門診428份生殖道分泌物的標本，利用PCR-熒光探針法分別檢測衣原體和淋球菌，并與乳膠法和淋球菌培養法比較。結果顯示PCR熒光探針法在衣原體和淋球菌的檢測中，其陽性率顯著高于乳膠法和淋球菌培養法，PCR結果與其他相關研究也較為一致［17-19］，這提示我們乳膠法和淋球菌培養法可能不能完全滿足臨床診斷需求。在我們入組的患者中，部分患者有生殖道刺激癥狀的出現，乳膠法檢測沙眼衣原體為陰性，而PCR法可以檢測到衣原體的存在，對患者的診斷和治療提供了明確的依據。考慮到PCR方法檢測的是病原體的核酸，可能存在治療后病原體核酸沒有清除而造成檢測結果的假陽性，我們特別關注首次就診時僅有PCR陽性而無臨床癥狀的患者，對這些患者進行治療后7d隨訪，結果顯示衣原體PCR結果均轉陰（結果未展示）。值得一提的是，2例女性其丈夫淋球菌培養和PCR都為陽性，臨床明確診斷為淋病，但她們淋球菌培養結果為陰性，PCR陽性，此時若僅僅依靠淋球菌的培養就會造成患者的漏診，留下健康隱患。PCR-熒光探針法操作步驟簡單，反應時間短，結果判定簡單客觀，靈敏度高且特異性好，不易受外界其他因素影響，克服了傳統PCR交叉污染易出現假陽性的缺點［20］，在規范化實驗室的前提下，此方法適合應用于臨床檢測大量樣本和在門診就診患者中作為篩查方法。同時我們的研究顯示，性病門診中21-40歲的就診者人數最多，此年齡段人群處于生育階段且性生活較為活躍，是衣原體和淋球菌感染的重點關注對象，而衣原體和淋球菌的感染可引起不孕不育，PCR熒光探針法的應用可以避免不孕不育等嚴重結局的發生。

總之，通過本研究的闡述表明PCR-熒光探針法技術在衣原體和淋球菌檢測中的應用可以提高檢出率，對臨床衣原體和淋球菌的感染的早期診斷有重要意義，尤其是在生育階段人群和無癥狀感染患者中，早期發現和及時治療可以避免不孕不育等嚴重不良結局的發生。

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（2016-01-08收稿）

doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2016.03.005

中圖分類號R 759

*通訊作者，Email： lyl@wzmc.edu.cn

Detection rate analysis of Chlamydia and gonococcal infection in STD clinic using PCR fl uorescence probe method

Wu Kaiqi1， Zhong Qi2， Zhou Pingyu3， Lou Yongliang1*
1. School of Laboratory Medicine， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China；2. Clinical laboratory， Shanghai Tenth People's Hospital， Shanghai； 3. STD Institute， Shanghai Skin Disease Hospital， Shanghai Corresponding author： Lou Yongliang， Email： lyl@wzmc.edu.cn

AbstractObjectiveTo comparatively analyze the detection rate of trachomatis and gonorrhoeae in genital tract secretion using PCR fluorescence probe method， Emulsion method， and Neisseria gonorrhoeae culture method. MetthhooddssGenital tract secretion samples of 428 patients from Qiujiang Branch of Shanghai Skin Disease Hospital STD clinic during March 2015 to December 2015 were collected. Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae in genital tract secretions were detected by PCR- fl uorescent probe， Emulsion method and Neisseria gonorrhoeae culture method， respectively. Ressuullttss（1） Among 428 specimens， the positive rate of Chlamydia using PCR- fluorescent probe method was significantly higher than that using Emulsion method（9.95% vs 4.21%）， P＜0.01. （2） Among 428 specimens， the positive rate of Neisseria gonorrhoeae using PCR- fl uorescent probe method was signifi cantly higher than that using Neisseria gonorrhoeae culture method（7.24% vs 2.80%），P＜0.01. （3） PCR- fl uorescent probe method signifi cantly improved the detection rate of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae， it also improved early diagnosis and therefore treatment of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae infection. ConcluussiioonnDue to the higher sensitiveness of PCR- fl uorescent probe method， it can be widely used in the STD clinics to detect the Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae， which are helpful to early diagnosis and treatment of Chlamydia and Neisseria gonorrhoeae infection.

Key wordschlamydia trachomatis；neisseria gonorrhoeae；PCR fl uorescence probe method