濟川煎對“瀉劑結腸”大鼠的治療效果及作用機制研究

霍明東，張 波，陳玉根

210009 江蘇省南京市，東南大學附屬中大醫(yī)院肛腸科(霍明東，張波)；南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肛腸科(陳玉根)

?

濟川煎對“瀉劑結腸”大鼠的治療效果及作用機制研究

霍明東，張 波，陳玉根

210009 江蘇省南京市，東南大學附屬中大醫(yī)院肛腸科(霍明東，張波)；南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院肛腸科(陳玉根)

【摘要】目的了解濟川煎對“瀉劑結腸”大鼠的治療效果，并探討其作用機制。方法于2012年9月，選取健康成年無特定病原體(SPF級)SD大鼠48只，36只經大黃酸混懸液灌胃法制作大鼠“瀉劑結腸”動物模型，然后隨機分為模型組、聚乙二醇組及濟川煎組各12只；余未經造模處理的12只為對照組。對照組和模型組采用0.9%氯化鈉溶液灌胃，聚乙二醇組采用聚乙二醇4000水溶液灌胃，濟川煎組采用濟川煎水煎液灌胃。檢測并比較4組大鼠的糞便干濕重比、首粒黑便排出時間，以及結腸組織酪氨酸激酶受體的干細胞因子受體(c-kit)和其配體干細胞因子(SCF)的mRNA、蛋白表達水平。結果濟川煎組大鼠的糞便干濕重比低于模型組、聚乙二醇組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。聚乙二醇組大鼠的糞便干濕重比高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。濟川煎組大鼠的首粒黑便排出時間長于對照組，短于模型組和聚乙二醇組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聚乙二醇組大鼠的首粒黑便排出時間長于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。濟川煎組大鼠c-kit、SCF的mRNA和蛋白表達水平高于模型組、聚乙二醇組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。聚乙二醇組大鼠c-kit、SCF的mRNA和蛋白表達水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論濟川煎可提高“瀉劑結腸”大鼠的結腸動力，軟化糞便，治療效果較好，其機制可能與修復SCF/c-kit信號通路有關。

【關鍵詞】便秘；瀉劑結腸；濟川煎；治療結果

霍明東，張波，陳玉根.濟川煎對“瀉劑結腸”大鼠的治療效果及作用機制研究[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(13)：1598-1601.[www.chinagp.net]

Huo MD,Zhang B,Chen YG.Therapeutic effect of jichuan decoction on rats with cathartic colon and its mechanism[J].Chinese General Practice，2016，19(13)：1598-1601.

“瀉劑結腸”是慢傳輸型便秘的一種重要類型，患者由于長期服用刺激性瀉劑，導致結腸動力進行性減退，最終依賴瀉劑排便[1]。“瀉劑結腸”的臨床癥狀較為頑固，病情呈持續(xù)性進展，嚴重影響了患者的生活質量，但目前尚缺乏有效治療手段[2]。聚乙二醇是世界胃腸組織推薦的便秘治療藥物，中藥濟川煎也常被應用于頑固性便秘的臨床治療，且臨床效果較好[3-5]，但目前關于其對“瀉劑結腸”治療效果的研究較少。本課題組在前期研究中，采用大黃酸混懸液灌胃法成功建立了“瀉劑結腸”大鼠模型[6]，并在此基礎上開展進一步研究，發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體的干細胞因子受體(c-kit)與其配體干細胞因子(SCF)在“瀉劑結腸”的發(fā)病機制中起著重要作用[7]。本研究旨在探討濟川煎對“瀉劑結腸”大鼠的治療效果，并探討其作用機制，以期為濟川煎的臨床應用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實驗動物于2012年9月，選取健康成年無特定病原體(SPF級)SD大鼠48只，雌雄各半，體質量180～220 g，由東南大學醫(yī)學實驗動物中心提供〔實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2010-0004；合格證號：0023515〕。

1.2實驗室藥品及設備濟川煎(肉蓯蓉20 g、當歸30 g、牛膝10 g、澤瀉10 g、升麻10 g、枳殼20 g)水煎液，濃縮至60 ml，由東南大學附屬中大醫(yī)院中藥房提供；大黃酸由南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司提供；2%大黃酸混懸液：將大黃酸2 g加入100 ml 0.9%氯化鈉溶液中；聚乙二醇4000水溶液：將聚乙二醇4000 20 g加入60 ml蒸餾水中。反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)試劑盒由大連TAKARA公司提供；BCA蛋白定量試劑盒和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配置試劑盒由北京碧云天生物技術有限公司生產；兔來源甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、c-kit、SCF多克隆一抗和羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)二抗由美國Santa Cruz公司提供。

1.3方法48只大鼠中，36只經大黃酸混懸液灌胃法制作大鼠“瀉劑結腸” 大鼠模型，然后隨機分為模型組、聚乙二醇組及濟川煎組各12只；余未經造模處理的12只為對照組。

1.3.1建立“瀉劑結腸”大鼠模型采用大黃酸混懸液灌胃法，制作大鼠“瀉劑結腸”動物模型。共經歷3個循環(huán)，分別為：(1)隔日灌胃，1.2 ml·100 g-1·次-1；(2)灌胃5 d停2 d，1.2 ml·100 g-1·次-1；(3)灌胃5 d停2 d，1.6 ml·100 g-1·次-1。各循環(huán)均以80.0%大鼠稀便消失為結束標準，造模時間共110 d。具體造模方法參照本課題組前期研究[6-7]。

1.3.2灌胃方法(1)模型組：以0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，連續(xù)30 d；(2)聚乙二醇組：以聚乙二醇4000水溶液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，連續(xù)30 d；(3)濟川煎組：以濟川煎水煎液灌胃，1次/d，10 ml·kg-1·次-1，連續(xù)30 d；(4)對照組：以0.9%氯化鈉溶液灌胃，灌胃頻率及用量同模型組。

1.3.3糞便干濕重比和首粒黑便排出時間檢測停止灌胃后1周，收集大鼠2～4粒剛排出糞便，放入150 ℃烤箱中烘烤15 min，烘烤前、后均稱取質量，糞便干濕重比=烘烤后質量/烘烤前質量×100.0%；以10.0%活性炭懸液3 ml灌胃，記錄大鼠首粒黑便排出時間。

1.3.4結腸組織取材及c-kit和SCF的mRNA、蛋白水平檢測腹腔注射3.0%戊巴比妥鈉1 ml/kg，對大鼠進行麻醉；切開大鼠腹壁各層，取中段結腸組織4塊，置于-70 ℃冰箱中凍存。采用RT-PCR法檢測大鼠結腸組織c-kit和SCF的mRNA表達水平，采用蛋白印跡(Western blotting)法檢測結腸組織c-kit和SCF的蛋白表達水平，以GAPDH為內參照，具體方法參照前期研究[7]。

2結果

2.14組大鼠糞便干濕重比和首粒黑便排出時間比較(1)4組大鼠糞便干濕重比比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，濟川煎組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而與模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(2)4組大鼠首粒黑便排出時間比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，濟川煎組與對照組、模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

2.24組大鼠結腸組織c-kit、SCF的mRNA表達水平比較4組大鼠c-kit、SCF的mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，濟川煎組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而與模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2、圖1)。

2.34組大鼠結腸組織c-kit和SCF的蛋白表達水平4組大鼠c-kit、SCF的蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中，濟川煎組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而與模型組、聚乙二醇組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。聚乙二醇組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3、圖2)。

Table1Comparisonoffecesdry-wetratioandfirstblackstooltimeamongthefourgroups

組別例數(shù)糞便干濕重比(%)首粒黑便排出時間(min)對照組1243.1±3.1391.7±34.5模型組1252.2±4.2a489.9±26.9a聚乙二醇組1250.3±2.3a493.1±43.7a濟川煎組1242.2±2.7bc421.3±26.8abcF值26.87344.435P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聚乙二醇組比較，cP<0.05

Table2ComparisonofmRNAlevelsofc-kitandSCFincolontissueamongthefourgroups

組別例數(shù)c-kitmRNASCFmRNA對照組120.88±0.100.85±0.09模型組120.29±0.09a0.28±0.09a聚乙二醇組120.31±0.10a0.30±0.09a濟川煎組120.79±0.09bc0.76±0.09bcF值100.28188.917P值<0.001<0.001

注：c-kit=干細胞因子受體，SCF=干細胞因子；與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聚乙二醇組比較，cP<0.05

注：c-kit=干細胞因子受體，SCF=干細胞因子，GAPDH=甘油醛-3-磷酸脫氫酶

圖14組大鼠結腸組織c-kit和SCF的mRNA表達

Figure 1The mRNA expression of c-kit and SCF in colon tissue among the four groups

Table3Comparisonofproteinlevelsofc-kitandSCFincolontissueamongthefourgroups

組別例數(shù)c-kit蛋白SCF蛋白對照組120.81±0.100.79±0.10模型組120.37±0.09a0.37±0.09a聚乙二醇組120.38±0.08a0.38±0.08a濟川煎組120.80±0.09bc0.79±0.09bcF值105.303105.638P值<0.001<0.001

注：與對照組比較，aP>0.05；與模型組比較，bP<0.05；與聚乙二醇組比較，cP<0.05

圖2　4組大鼠結腸組織c-kit和SCF的蛋白表達

Figure 2Protein expression of c-kit and SCF in colon tissue among the four groups

3討論

刺激性瀉劑的長期服用和結腸動力的進行性下降是“瀉劑結腸”的重要特征。“瀉劑結腸”患者長期服用番瀉葉、大黃等刺激性瀉劑，劑量隨使用時間的延長而增加，但結腸動力卻呈進行性下降，最終不得不依賴瀉劑排便。“瀉劑結腸”患者因過用苦寒藥物而伐傷陽氣，寒涼傷陽，瀉下傷朔，導致陰陽兩虛，脾無力運化，腎陽不能溫煦，腎陰不能滋養(yǎng)，腸寒且燥，屬中醫(yī)脾腎兩虛、氣機淤滯證型。

濟川煎出自明代《景岳全書》，由肉蓯蓉、當歸、牛膝、澤瀉、升麻、枳殼6種中藥組成，為溫陽法治療便秘的常用方，在多種便秘的臨床治療中取得了較為滿意的療效[8-10]。但濟川煎對“瀉劑結腸”的治療效果如何，尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究用濟川煎治療“瀉劑結腸”大鼠30 d，結果顯示，與模型組相比，濟川煎組大鼠的首粒黑便排出時間縮短，糞便干濕重比降低，說明濟川煎能夠提高“瀉劑結腸”大鼠的結腸動力，軟化糞便，治療效果較好。

近期研究結果表明，Cajal間質細胞(ICC)對胃腸動力的調控起著至關重要的作用[11-14]。ICC是一類極其特殊的間質細胞，介于腸神經系統(tǒng)和平滑肌細胞之間，可調控腸神經信號向效應器平滑肌細胞的傳遞。ICC特異性表達酪氨酸激酶受體c-kit，c-kit與SCF組成的SCF/c-kit信號通路已被證實對ICC具有重要調控作用[15-18]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，長期

使用大黃酸可導致大鼠結腸動力減退，破壞大鼠正常SCF/c-kit信號通路[7]。本研究檢測了各組大鼠結腸組織c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達水平，結果顯示，與模型組相比，濟川煎組大鼠結腸組織中c-kit和SCF 的mRNA、蛋白表達水平較高，且與對照組比較無差異。說明濟川煎的結腸動力改善作用可能與其提高了c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達水平，修復SCF/c-kit信號通路有關。另外，濟川煎組大鼠的糞便干濕重比與對照組比較無差異，但首粒黑便排出時間長于對照組，說明濟川煎組大鼠的結腸動力與正常水平還存在差距。其可能原因為：(1)濟川煎的治療時間未達到結腸組織中ICC的數(shù)量及表型轉化恢復所需時間；(2)“瀉劑結腸”發(fā)病機制較為復雜，除SCF/c-kit信號通路外，尚存在其他因素參與。

本研究結果還顯示，聚乙二醇組與模型組相比，糞便干濕重比和首粒黑便排出時間均無差異，說明聚乙二醇雖然可以保留大鼠腸道內的水分，軟化糞便，但其不能有效提高大鼠的結腸動力。聚乙二醇組大鼠c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達水平與模型組比較也無差異，說明其在治療過程中無法修復異常的SCF/c-kit信號通路。

綜上所述，濟川煎可以提高“瀉劑結腸”大鼠的結腸動力，軟化糞便，治療效果較好。其機制可能與提高結腸組織中c-kit和SCF的mRNA、蛋白表達水平，修復SCF/c-kit信號通路有關。但“瀉劑結腸”的發(fā)生機制較為復雜，是否存在其他影響因素尚有待進一步研究，濟川煎對“瀉劑結腸”的治療效果也有待大規(guī)模的臨床研究來證實。

作者貢獻：霍明東進行實驗設計與實施、撰寫論文、成文并對文章負責；張波進行實驗實施、評估、資料收集；陳玉根進行質量控制與審校。

本文無利益沖突。

參考文獻

[1]中華醫(yī)學會消化病學分會胃腸動力學組，中華醫(yī)學會外科學分會結直腸肛門外科學組.中國慢性便秘的診治指南[J].胃腸病學，2013，18(10)：605-612.

[2]高志霞.老年糖尿病患者便秘的護理體會[J].實用心腦肺血管病雜志，2013，21(6)：157.

[3]郭毅，黃衛(wèi)平，任偉濤，等.濟川煎加味治療脾腎陽虛型便秘120例[J].光明中醫(yī)，2012，27(9)：1795-1796.

[4]陸德成，劉翠清，王晉陽，等.濟川煎治療老年功能性便秘43例臨床療效觀察[J].實用中西醫(yī)結合臨床，2014，14(8)：20-21.

[5]Lyu LY,He XW,Xu H,et al.Clinical observation on 140 cases on functional constipation who were treated by modifying jichuan decoction[J].Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine,2012,30(6)：87-88.(in Chinese)

呂靈儀，賀小婉，徐紅，等.濟川煎加減治療功能性便秘140 例臨床觀察[J].四川中醫(yī)，2012，30(6)：87-88.

[6]張波，丁義江.大黃酸建立“瀉劑結腸”大鼠模型的研究[J].時珍國醫(yī)國藥雜志，2012，23(7)：1815-1816.

[7]Huo MD,Ding SQ,Ding YJ,et al.The role of SCF / c-kit signaling pathway on "cathartic colon" pathogenesis[J].World Chinese Journal of Digestology,2013,21(9):809-813.(in Chinese)

霍明東，丁曙晴，丁義江，等.SCF/c-kit信號通路在“瀉劑結腸”發(fā)病機制中的作用[J].世界華人消化雜志，2013，21(9)：809-813.

[8]Wang XY,Li MZ,Wang SB.Observation on the therapeutic efficacy of elderly functional constipation with modified jichuan decoction random parallel control study[J].Journal of Practical Traditional Chinese Internal Medicine,2014,29(4):82-84.(in Chinese)

王學妍，李明哲，王士彪.濟川煎加味治療中老年功能性便秘(虛秘)隨機平行對照研究[J].實用中醫(yī)內科雜志，2014，29(4)：82-84.

[9]羅虹.濟川煎加味治療阿爾茨海默病患者便秘40例[J].浙江中醫(yī)雜志，2013，48(9)：658-659.

[10]Yang L.Observation of jichuanjian therapeutic on functional constipation[J].Journal of Practical Traditional Chinese Internal Medicine,2012,26(3):40-41.(in Chinese)

楊麗.濟川煎加減治療功能性便秘對照觀察[J].實用中醫(yī)內科雜志，2012，26(3)：40-41.

[11]Streutker CJ,Huizinga JD,Driman DK,et al.Interstitial cells of Cajal in health and disease.Part I:normal ICC structure and function with associated motility disorders[J].Histophathology,2007,50(2):176-189.

[12]Sanders KM,Ward SM.Interstitial cells of Cajal:a new perspective on smooth muscle function[J].Physiol,2006,576(3):721-726.

[13]Farrugia G.Interstitial cells of Cajal in health and disease[J].Neurogastroenterol Motil,2008,20(1):54-63.

[14]Shi H,Lu J,Cheng P,et al.Expressions and clinical significance of human macrophage metalloelastase,hypoxia induced factor-1α and vascular endothelial growth factor in gastric cancer[J].Anhui Medical Journal,2015,36(7):880-883.(in Chinese)

石海，盧杰，程芃，等.巨噬細胞金屬彈力酶缺氧誘導因子-1α及血管內皮生長因子在胃癌中的表達及其意義[J].安徽醫(yī)學，2015，36(7)：880-883.

[15]Horvath VJ,Vittal H,Lorincz A,et al.Reduced stem cell factor links smooth myopathy and loss of interstitial cells of Cajal in murine diabetic gastroparesis[J].Gastroenterology,2006,130(3):759-770.

[16]Jia HJ,Tong WD,Liu BH.Relationship of gastrointestinal Cajal cells and stem cell factor/c-kit signaling pathway[J].Journal of Medical Postgraduates,2010,23(2):192-195.(in Chinese)

賈后軍，童衛(wèi)東，劉寶華.胃腸道Cajal間質細胞與干細胞因子/c-kit信號途徑關系[J].醫(yī)學研究生學報，2010，23(2)：192-195.

[17]Bashamboo A,Taylor AH,Samuel K,et al.The survival of differentiating embryonic stem cells is dependent on the SCF-KIT pathway[J].J Cell Sci,2006,119(15):3039-3046.

[18]Peng MF,Li K,Wang C,et al.Therapeutic effect and mechanism of electroacupuncture at Zusanli on plasticity of interstitial cells of Cajal:a study of rat ileum[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2014,14:186.

(本文編輯：王鳳微)

Therapeutic Effect of Jichuan Decoction on Rats With Cathartic Colon and Its Mechanism

HUOMing-dong,ZHANGBo,CHENYu-gen.

DepartmentofAnorectalDiseases,ZhongdaHospitalSoutheastUniversity,Nanjing210009,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of jichuan decoction on rats with cathartic colon and its mechanism.MethodsIn September 2012,48 healthy adult SPF SD rats without specific pathogen free were selected,and 36 model rats with cathartic colon were made by gavage of parietic acid injectable suspension.The 36 model rats were assigned into model group,polyethylene glycol group and jichuan decoction group,with 12 rats in each group;the rest 12 rats that were not built into models were assigned into control group.Control group and model group were administrated with 0.9% sodium chloride solution by gavage;polyethylene glycol group was administrated with polyethylene glycol 4000 water solution by gavage;jichuan decoction group was administrated with water decoction of Jichuan.The feces dry-wet ratio,first black stool time,and the mRNA and protein expression level of colon tissue c-kit and SCF of the four groups were detected and compared.ResultsJichuan decoction group was lower than model group and polyethylene glycol group in feces dry-wet ratio(P<0.05),but was not significantly different from control group(P>0.05).Polyethylene glycol group was higher than control group in feces dry-wet ratio(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).Jichuan decoction group was longer than control group in first black stool time,but was shorter than model group and polyethylene glycol group(P<0.05).Polyethylene glycol group was longer than control group in first black stool time(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).Jichuan decoction group was higher than model group and polyethylene glycol group in the mRNA and protein levels of c-kit and SCF(P<0.05),but was not significantly different from control group(P>0.05).Polyethylene glycol group was lower than control group in the mRNA and protein levels of c-kit and SCF(P<0.05),but was not significantly different from model group(P>0.05).ConclusionJichuan decoction can improve the colonic motility of rats with cathartic colon and make their feces soften.Its efficacy is favorable,and the mechanism may be related with repairing the signal path of SCF/c-kit.

【Key words】Constipation;Cathartic colon;Jichuan decoction;Treatment outcome

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81373645)；江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(LZ13242、PY201517)

通信作者：張波，210009 江蘇省南京市，東南大學附屬中大醫(yī)院肛腸科；E-mail：13400057505@163.com

【中圖分類號】R 442.2

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.13.028

(收稿日期：2016-01-03；修回日期：2016-03-16)

·中醫(yī)·中西醫(yī)結合研究·