乳腺癌不同轉移類型患者基質金屬蛋白酶1表達情況研究

丁 梅，胡 芬，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華

063000河北省唐山市協和醫院普外一科(丁梅，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華)；華北理工大學生命科學學院(胡芬)

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·論著·

乳腺癌不同轉移類型患者基質金屬蛋白酶1表達情況研究

丁 梅，胡 芬，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華

063000河北省唐山市協和醫院普外一科(丁梅，王增輝，楊艷玲，馬振玲，李宗富，李潤華)；華北理工大學生命科學學院(胡芬)

【摘要】目的探討乳腺癌不同轉移類型患者基質金屬蛋白酶1(MMP-1)表達情況。方法選取2012年3月—2015年3月唐山市協和醫院普外一科收治的乳腺癌轉移患者186例，根據首次診斷發生轉移部位分為骨轉移組(A組，90例)、肝轉移組(B組，30例)、肺轉移組(C組，40例)、軟組織轉移組(D組，26例)4組。采用免疫組織化學染色法，對各組手術時獲得的癌組織標本進行MMP-1表達水平觀察。結果A、B組患者MMP-1表達水平均高于C、D組，差異有統計學意義(P<0.05)。同一臨床分期、病理類型、腋窩淋巴結轉移數，4組患者間差異有統計學意義(P<0.05)；同一組內，不同臨床分期、腋窩淋巴結轉移數患者MMP-1表達水平間差異有統計學意義(P<0.05)，而不同病理類型患者MMP-1表達水平間差異無統計學意義(P>0.05)。結論乳腺癌骨轉移、肝轉移患者的MMP-1呈高表達，MMP-1在臨床分期、腋窩淋巴結轉移數的判斷上具有一定參考價值。

【關鍵詞】乳腺腫瘤；腫瘤轉移；基質金屬蛋白酶1

丁梅，胡芬，王增輝，等.乳腺癌不同轉移類型患者基質金屬蛋白酶1表達情況研究[J].中國全科醫學，2016，19(13)：1533-1536，1547.[www.chinagp.net]

Ding M,Hu F,Wang ZH,et al.Expression of MMP-1 of patients with breast cancer of different metastasis types[J].Chinese General Practice，2016，19(13)：1533-1536，1547.

人類對乳腺癌治療的探索已有100多年的歷史，但全球每年因該病死亡的患者仍有40萬之多[1]。乳腺癌轉移是惡性腫瘤的固有特征，也是患者死亡的主要原因之一，但其惡化、轉移的機制較為復雜，目前仍未完全明釋，因此探尋其病因、浸潤轉移機制一直是該領域研究的難點、熱點。研究表明，癌細胞誘導產生的蛋白酶降解細胞外基質和基底膜能力與其浸潤轉移能力呈正相關[2]。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)對細胞外基質(extracellular matrix，ECM)具有重要的調節作用，其在正常組織中的激活、釋放、抑制是受到嚴格控制的，而癌癥發生時調節失控，則促使癌細胞侵襲、轉移[3]。基質金屬蛋白酶1(MMP-1)是第1個被定性的MMPs，也是MMPs家族中為數不多的能天然降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的水解酶之一，由169個氨基酸組成[4]。MMP-1通過降解細胞外基質而清除細胞轉移過程中的物理屏障，因此在癌細胞轉移過程中發揮著重要作用。目前，國內關于MMP-1在乳腺癌發生、發展中的臨床特征觀察并不多見，本研究擬通過免疫組織化學染色法觀察MMP-1在乳腺癌不同轉移類型患者中的表達情況，為MMP抑制劑的合理開發利用提供參考。

1對象與方法

1.1研究對象選取2012年3月—2015年3月唐山市協和醫院普外一科收治的乳腺癌轉移患者186例。納入標準：(1)根據我國2011年發布的行業標準[5]進行診斷，具體為：乳房腫物，質硬、固定、伴有皮膚凹陷或腋窩淋巴結腫大、短期內腫物明顯增大等為首發癥狀，或可出現乳頭近期回縮、血性溢液，單側乳頭乳暈區皮膚濕疹樣改變且常規治療無改善；(2)經CT、X線、MRI等影像學檢查符合轉移癌診斷標準[6]；(3)女性，均在本院進行初始治療、手術、化療、放療等正規治療；(4)轉移發生均為術后首次發現，術前未經過化療、放療。排除標準：(1)合并有其他惡性腫瘤者；(2)未進行手術治療，臨床資料欠缺者；(3)非單純轉移者。根據首次診斷發生轉移部位分為骨轉移組(A組，90例)、肝轉移組(B組，30例)、肺轉移組(C組，40例)、軟組織轉移組(D組，26例)4組，其中各部位轉移發生率分別為48.4%、16.1%、21.5%、14.0%。研究經本院醫學倫理委員會審核、批準，患者均了解研究內容，并簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1治療方法患者根據病情需要選擇根治術(A組57例、B組22例、C組35例、D組16例)、改良根治術(A組27例、B組5例、C組4例、D組2例)、保留乳房切除術(A組6例、B組3例、C組1例、D組8例)；所有入選者均進行術后輔助化療，化療方案包括TA(多西他賽聯合表阿霉素方案，A組19例、B組7例、C組9例、D組3例)、CEF(表柔比星、環磷酰胺聯合氟尿嘧啶方案，A組41例、B組20例、C組21例、D組14例)、CMF(甲胺喋呤、環磷酰胺聯合5-氟尿嘧啶方案，A組13例、C組5例、D組6例)、NE(表阿霉素聯合諾維本方案，A組17例、B組3例、C組5例、D組3例)。

1.2.2病理組織準備標本均于手術時獲得，使用4%甲醛溶液固定，進行石蠟包埋，連續切片4 μm，共3張，以便免疫組織化學染色使用。

1.2.3免疫組織化學染色將標本放在60 ℃溫箱內烤片1 h，使用梯度酒精(100%、95%、90%、80%、70%)及二甲苯進行脫蠟，水化至蒸餾水，洗滌〔0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)〕5 min、3次；將切片浸泡于3%的過氧化氫(H2O2)溶液中0.5 h，使內源性過氧化酶失活，再洗滌(0.01 mol/L PBS緩沖液)5 min、3次；準備盛有枸櫞酸鹽抗原修復液的器皿，將切片浸入其中，再放入壓力蒸氣滅菌器中，高壓修復20 min，待冷卻后洗滌(0.01 mol/L PBS緩沖液)5 min、3次；將切片上的PBS緩沖液吸去，滴加10%山羊血清，濕盒內放置0.5 h使特異性反應得到中和；去除多余血清，在切片上滴加PBS緩沖液稀釋的一抗，然后放置于濕盒，4 ℃，10 h；將濕盒置于室溫下0.5 h，復溫后洗滌(0.01 mol/L PBS緩沖液)5 min、3次；除水后加生物素化二抗，在37 ℃下濕盒內孵育20 min，洗滌(0.01 mol/L PBS緩沖液)5 min、3次；加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，在37 ℃下濕盒內孵育20 min，洗滌(0.01 mol/L PBS緩沖液)5 min、3次；取1 ml蒸餾水加入DAB顯色試劑盒A、B、C試劑各1滴，混勻后滴于切片，在暗室中顯色，使用自來水終止顯色，利用顯微鏡控制顯色時間。

1.2.4結果判定由資深醫師在完全不了解任何臨床及病理資料的情況下，對切片進行評估。每張切片隨機選擇10個400倍高倍視野，選取染色較為集中的區域計數細胞，連續計數100個腫瘤細胞及其陽性細胞數，以細胞內存在棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞，每高倍鏡視野的陽性染色細胞數按百分比進行計數。

2結果

2.14組患者一般資料比較4組患者年齡、臨床分期、病理類型、腋窩淋巴結轉移數間差異均無統計學意義(P>0.05，見表1)，具有可比性。

2.24組患者MMP-1表達水平比較4組患者MMP-1表達水平間差異有統計學意義(P<0.05)，其中C、D組與A、B組比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.34組不同臨床分期、病理類型、腋窩淋巴結轉移數患者MMP-1表達水平比較同一臨床分期、病理類型、腋窩淋巴結轉移數，4組患者間差異均有統計學意義(P<0.05)；同一組內，不同臨床分期、腋窩淋巴結轉移數患者MMP-1表達水平間差異有統計學意義(P<0.05)，而不同病理類型患者MMP-1表達水平間差異無統計學意義(P>0.05，見表3)。

表1　4組患者一般資料比較

注：a為χ2值

Table3ComparisonoftheexpressionofMMP-1ofpatientswithdifferentclinicalstages,pathologicaltypesandnumbersofaxillarylymphnodemetastasisamongthefourgroups

組別 臨床分期Ⅱ Ⅲ t值 P值病理類型浸潤性非特殊癌 浸潤性特殊癌 t值 P值 腋窩淋巴結轉移數0個 1～3個 ≥4個 F值 P值A組70.2±18.376.2±8.82.010.0473.2±20.274.2±18.90.240.8168.2±19.270.3±16.176.9±10.1cd3.310.04B組66.3±16.175.1±5.12.180.0366.9±22.268.3±17.60.180.8665.3±12.668.3±7.376.1±8.3cd3.400.04C組55.2±14.663.2±9.12.120.0457.8±20.158.1±17.20.050.9657.3±10.258.0±4.165.2±10.1cd3.680.03D組52.2±5.0ab62.7±15.1ab2.110.0453.2±15.1ab52.2±19.0ab0.140.8950.2±10.1ab52.1±13.1ab60.1±15.6abcd3.310.04F值5.7014.454.996.402.838.288.44P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.05<0.01<0.01

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與0個比較，cP<0.05；與1～3個比較，dP<0.05

表2　4組患者MMP-1表達水平比較

注：MMP-1=基質金屬蛋白酶1；與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

3討論

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的疾病之一，是最常見的惡性腫瘤，15%～20%的患者術后發生遠處轉移，且該病治療失敗的最終原因就是復發及遠處轉移。乳腺癌最常見的遠處轉移部位是骨(發生率達70%以上)，其次是肺、肝(8%～14%)，腦轉移較為少見[7]。本研究中骨轉移發生率為48.4%，肺轉移為21.5%，肝轉移為16.1%，軟組織轉移為14.0%，骨轉移仍然是最主要類型，但本研究中各轉移類型均為單一發生部位，合并轉移者均予剔除，且觀察范圍較為有限，這會造成與相關報道數據上的差異。

惡性腫瘤在生長過程中，原發灶會分泌MMPs，在人類已發現的23種MMPs中，包括6種膜相關酶和17種分泌型酶，分為膠原酶、明膠酶、膜型、基質溶素4種亞型，MMP-1屬于膠原酶，其基因位于人類染色體11q22，由巨噬細胞、成纖維細胞、內皮細胞等分泌，其在乳腺癌、結腸癌、食管癌等患者中均呈高表達[8]。有研究顯示，位于MMP-1基因啟動子區的1G/2G單核苷酸多態性是功能性多態，其-1606位點的2G等位基因能夠上調基因轉錄活性，使蛋白表達水平上調[9]。MMP-1在乳腺癌轉移中的機制主要為以下兩個方面：(1)發生轉移時，MMP-1促使細胞外基質膠原纖維等成分的溶解，破壞血管基底膜，進而侵犯循環系統，乳腺癌細胞開始穿越基膜，通過基膜和間質結締組織，在目標臟器上形成轉移灶[10]。(2)轉移灶出現后如果沒有新生血管的長入，其大小不會超過2 mm2，研究表明MMP-1在新生血管啟動上發揮重要作用，其機制可能是MMP-1對細胞外基質中纖維蛋白、膠原、層黏素等進行降解，使血管內皮細胞向腫瘤方向進行增殖，使原有血管發出新支，且對血管形成后的管腔、基底膜進行重塑[11]。趙賢寶[12]在觀察80例大腸癌患者術后切除標本的MMP-1表達時發現，微血管密度與MMP-1表達呈正相關(r=0.642，P<0.01)。腫瘤新生血管的分化較低，癌細胞易于透過，進入血液循環，遠端轉移更易發生。

本研究結果顯示，骨轉移與肝轉移患者均有較高的MMP-1表達水平，但二者間無差異。乳腺癌細胞易侵犯骨質，造成骨形成與骨質吸收的平衡紊亂，骨質流失，有報道指出破骨細胞對骨的降解作用可能是乳腺癌骨轉移的重要影響因素，而這種降解則是在MMPs的催化下發生的[13]。那么，MMP-1的表達水平越高，骨降解作用越明顯，發生骨轉移的概率越高。在各型轉移中，骨轉移患者的生存期明顯優于其他器官轉移者，因此有較為充分的時間進行全身治療，該型患者應以減少骨折、癱瘓、疼痛，提高患者生活質量、延長生存時間為目的，臨床常在化療的基礎上進行放射性核素、二磷酸鹽、內分泌等治療[14]。本研究骨轉移患者MMP-1的表達較為突出，表現出一定的特異性，推測此型患者或對MMP-1抑制劑有較好的敏感性，這有待進一步的臨床實踐觀察。肝轉移存在于55%～75%的乳腺癌死亡患者中，此類患者預后較差，中位生存期約14個月[15]。乳腺癌細胞具有嗜靶器官性，肝臟微環境對乳腺癌細胞的生物學行為具有一定影響，但具體機制尚不清楚，或與肝內趨化因子及其受體相關，或與miRNA表達相關，或與閉合蛋白相關[16]。本研究肝轉移患者表現出較高的MMP-1水平，提示肝轉移的發生與MMP-1水平或具有相關性，但其中機制尚有待進一步研究闡釋。

有研究顯示，乳腺癌中浸潤性非特殊癌約占80%，是病理中的主要類型[17]。本研究中浸潤性非特殊癌患者占57.0%(106/186)，亦為主體類型。從各組內MMP-1表達來看，浸潤性非特殊癌和浸潤性特殊癌未表現出明顯差異，說明同一轉移類型MMP-1的病理學表達特異性不明顯。淋巴結陽性數與乳腺癌轉移、復發呈正相關，腋窩淋巴結轉移狀態是反映腫瘤播散能力的重要指標[18]。本研究結果顯示，淋巴結轉移數越多，MMP-1的表達水平越高，各組內MMP-1表達水平在淋巴結轉移數≥4個中均值最高，說明MMP-1表達在一定程度上能夠反映腫瘤浸潤、播散能力。此外，從臨床分期情況來看，各組內Ⅲ期MMP-1表達水平均高于Ⅱ期，提示MMP-1水平或可對臨床分期的判斷提供參考。病理類型、淋巴結轉移數、臨床分期的不同層次下均表現出了明顯的組間差異，這可能是不同轉移類型對MMP-1刺激程度、表達水平的差異造成，也有待大樣本、多中心的臨床觀察進行證實，其確切的機制尚有待進一步研究證實。

體外研究顯示，MMPs抑制劑主要通過對細胞外基質游走、聚集的抑制而發揮作用，通過切斷轉移途徑而非直接作用于腫瘤細胞本身，因此此類藥物較難產生抗藥性[19]。但目前MMPs的應用情況并不理想，考慮是缺乏特異性的合理應用造成，本研究顯示不同轉移類型的乳腺癌患者MMP-1水平間存在差異，提示在應用MMP-1抑制劑時應參考轉移高危人群特點實施。本研究缺乏對MMP-1基因多態性的分析，在未來研究中，可對MMP-1基因多態性在乳腺癌轉移人群中的分布進行探討，為MMPs抑制劑的使用提供更多參考。

作者貢獻：丁梅進行試驗設計與實施、撰寫論文、成文并對文章負責；胡芬進行質量控制與審校；王增輝、楊艷玲、馬振玲、李宗富、李潤華進行試驗實施、評估、資料收集。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔沙沙)

Expression of MMP-1 of Patients With Breast Cancer of Different Metastasis Types

DINGMei,HUFen,WANGZeng-hui,etal.

TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,TangshanUnionMedicalCollegeHospital,Tangshan063000，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of MMP-1 of patients with breast cancer of different metastasis types.MethodsFrom March 2012 to March 2015,we enrolled 186 patients with breast cancer metastasis who received treatment in the First Department of General Surgery of Tangshan Union Medical College Hospital.According to the site of metastasis,these patients were divided into four groups:bone metastasis group(group A,n=90),liver metastasis group(group B,n=30),lung metastasis group(group C,n=40),and soft tissue group(group D,n=26).Immunohistochemistry staining was used to observe the expression of MMP-1 in the cancer tissue samples of each group.ResultsGroup A and group B were higher than group C and group D in the expression of MMP-1 (P<0.05).The four groups were significantly different in the expression of MMP-1 in patients of same clinical stage,pathological type or with same number of axillary lymph node metastasis (P<0.05).In the same group,patients with different clinical stages and numbers of axillary lymph node metastasis were significantly different in the expression of MMP-1 (P<0.05),and patients with different pathological types were not significantly different in the expression of MMP-1(P>0.05).ConclusionPatients with breast cancer bone metastasis and liver metastasis have high expression of MMP-1,and MMP-1 has reference value for the determination of clinical staging and the number of axillary lymph node metastasis.

【Key words】Breast neoplasms;Neoplasm metastasis;Matrix metalloproteinase 1

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81302323)——BMP-6調控MMP表達抑制乳腺癌細胞轉移的功能和機理研究；河北省自然科學基金資助項目(c2014209140)——BMP-6調控MMP-1表達抑制乳腺癌細胞轉移的功能和機制研究

通信作者：胡芬，063000河北省唐山市，華北理工大學生命科學學院；E-mail：ihufen@126.com

【中圖分類號】R 737.9

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.13.013

(收稿日期：2016-01-08；修回日期：2016-03-14)