急性淋巴細胞白血病患兒外周血IL-17、IL-35及T淋巴細胞亞群的變化及意義

王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳

急性淋巴細胞白血病患兒外周血IL-17、IL-35及T淋巴細胞亞群的變化及意義

王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳

目的 本研究通過檢測急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒外周血中IL-17、IL-35水平及T淋巴細胞亞群表達，探討其在ALL發病中的作用。方法 選擇141例ALL患兒，其中初診76例(初診組)、治療后完全緩解65例(緩解組)，另選45例健康兒童為對照組。采用流式細胞術檢測各組患兒

CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞、CD 8+T淋巴細胞的表達，酶聯免疫吸附法檢測IL-17、IL-35的水平。結果 IL-17的水平：初診組(8.66±0.95)pg/ mL和緩解組(14.86±1.77)pg/mL均低于對照組(22.85±1.84)pg/mL(P<0.05)；IL-35的水平：初診組(164.72±8.99)pg/mL和緩解組(125.63±8.41) pg/mL均高于對照組(69.07±3.23)pg/mL(P<0.05)；CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞的表達水平：初診組［(60.75±3.16)%、（30.00±2.30）%］和緩解組［（67.31±2.94）%、（34.51±2.44）%］均低于對照組［（69.53±4.12）%、（38.18±2.39）%］(P<0.05)；CD 8+T淋巴細胞的表達水平：初診租（33.32±3.01）%和緩解組（29.54±2.70）%高于對照組(25.87±2.01%)(P<0.05)；初診組與緩解組之間的比較差異均有統計學意義(P<0.05)；CD 4+T淋巴細胞的表達水平與IL-17的水平呈正相關(r=0.678,P<0.01)，與IL-35的水平呈負相關(r=-0.688,P<0.01)。結論 ALL患兒存在不同程度的免疫異常，外周血中IL-17的低表達、IL-35的高表達，可能在ALL的發病中起重要作用。

急性淋巴細胞白血病；IL-17；IL-35；T淋巴細胞亞群；兒童

急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)是指由未分化或分化程度較低的淋巴細胞在骨髓、淋巴結及脾臟等造血器官內無限增殖所致的血液系統惡性腫瘤[1]，為兒童最常見的惡性腫瘤。研究顯示[2]，惡性腫瘤患者普遍存在免疫功能下降，主要體現在細胞免疫功能方面，且腫瘤的發生、發展與T淋巴細胞亞群有密切聯系。調節性T細胞(Tregs)和輔助性T細胞17(Th 17)是新近發現的CD 4+T淋巴細胞亞群。Th 17細胞主要通過白介素17(interleukin-17，IL-17)來發揮作用。白介素35(interleukin-35，IL-35)主要由Tregs分泌，是其發揮免疫負調控的主要細胞因子之一。本文將初步探討IL-17、IL-35 及T淋巴細胞亞群在ALL發病機制中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月～2015年4月在鄭州大學第三附屬醫院及第一附屬醫院就診的ALL患兒141例，其中初步確診但未治療的ALL患兒76例為初診組，男46例，女30例，年齡1～14歲，中位年齡6歲；已經確診并經系統化療達到完全緩解的ALL患兒65例為緩解組，男39例，女26例，年齡2～13歲，中位年齡6歲。診斷標準及化療方案均依據《小兒急性淋巴細胞白血病診療建議》[3]。另選同期本院兒童保健中心體檢正常的兒童45例作為對照組，男27例，女18例，年齡3～15歲，中位年齡7歲。對照組患兒性別、年齡與初診組、緩解組ALL患兒比較差異無統計學意義。本研究獲得本院人體試驗委員會批準及家屬的知情同意。

完全緩解的標準為[4]：（1）臨床無白血病細胞浸潤所致的癥狀和體征，生活正常或接近正常。（2）血象：Hb≥90 g/L，中性粒細胞絕對值≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L。外周血白細胞分類中無白血病細胞。（3）骨髓象：原始淋巴細胞＋幼稚淋巴細胞≤5%，紅細胞及巨核細胞系正常。

1.2 研究方法

1.2.1 標本的采集 初診組及緩解組患兒均于入院未治療前抽取外周靜脈血5mL，對照組為隨機抽取外周靜脈血5mL，其中3mL用EDTA管抗凝，6 h內流式細胞術分析，檢測T淋巴細胞亞群；2 mL置于普通干燥管中，2500 r/min離心10 min，分離血清后，置于-80℃保存。

1.2.2 主要試劑及儀器 C D 4F I T C/C D 8P E/ CD 3PerCP試劑及紅細胞裂解液均購自美國BD公司；IL-17、IL-35的ELISA試劑盒均購自美國R&D公司；酶標儀購自美國伯樂Bio-rad，洗板機購自美國熱電thermo；FACSCalibur型流式細胞儀為美國BD公司產品。

1.2.3 流式細胞術檢測CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞、CD 8+T淋巴細胞 先將流式管進行編號，然后將標本反復顛倒混勻；先取5μL CD 4FITC/CD 8PE/CD 3PerCP試劑加入到流式管底部，再取20 μL EDTA抗凝全血加入到流式管中，低速震蕩混勻，室溫避光15 min；加入200 μL 1×紅細胞裂解液，室溫避光10 min后上機，采用FACSComp軟件分析檢測。

1.2.4 細胞因子測定 外周血IL-17、IL-35水平的檢測采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，酶標儀檢測450 nm處吸光度值，以試劑盒提供的標準品繪制標準曲線，計算IL-17、IL-35水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理與分析。計量資料以“±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，變量間的相關性分析采用Pearson積矩相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血IL-17、IL-35的水平 初診組和緩解組IL-17的水平均低于對照組(P<0.05)，且初診組低于緩解組(P<0.05)；初診組和緩解組IL-35的水平均高于對照組(P<0.05)，且初診組高于緩解組(P<0.05)；各組間的比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組外周血IL-17、IL-35水平的比較(x±s,pg/mL)

2.2 T淋巴細胞亞群的水平 初診組和緩解組CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞的表達水平均低于對照組(P<0.05)，CD 8+T淋巴細胞的表達水平高于對照組(P<0.05)，初診組與緩解組之間的比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組外周血T淋巴細胞亞群測定結果的比較±s,%)

表2 各組外周血T淋巴細胞亞群測定結果的比較±s,%)

注:與對照組比較，aP<0.05；與緩解組比較，bP<0.05

組別例數CD 3+TCD 4+TCD 8+T對照組4569.53±4.1238.18±2.3925.87±2.01緩解組6567.31±2.94a34.51±2.44a29.54±2.70a初診組7660.75±3.16ab30.00±2.30ab33.32±3.01abF值117.92175.85111.88 P值＜0.01＜0.01＜0.01

2.3 相關性分析 ALL患兒外周血CD 4+T淋巴細胞的表達水平與IL-17的水平呈正相關(r＝0.678,P<0.01)，與IL-35的水平呈負相關(r＝-0.688,P<0.01)。

3 討論

急性白血病(acute leukemia,AL)占所有兒童惡性腫瘤的25%～35%，根據骨髓細胞形態學分型分為急性淋巴細胞白血病(ALL)和急性髓細胞白血病(AML)，兒童白血病以ALL為主，占60%～70%。其發病機制包括[5]：“二次打擊”學說（如：染色體異位形成融合基因、多基因參與的第二次打擊）、免疫因素、腫瘤干細胞等。近期的研究發現基因多態性也與白血病的易患性相關[6]，如葉酸代謝相關基因、細胞色素P 450和谷胱甘肽S-轉移酶、苯醌氧化還原酶-1等。此外，研究發現[7]CASP 8AP 2基因啟動子區-1189和-1176兩個CpG位點的異常高甲基化可能與兒童ALL的發病相關。由于白血病的生物多樣性，其病因及發病機制也是多因素的。本文主要從免疫因素方面探索兒童ALL的發病機制。

人體成熟T淋巴細胞亞群按功能不同可分為:輔助性T淋巴細胞(Th)、抑制性T淋巴細胞(Ts)和細胞毒性T淋巴細胞(Tc)；若按表型又可以分為CD 4+T淋巴細胞和CD 8+T淋巴細胞。CD 4+T淋巴細胞主要行使Th細胞的功能，而CD 8+T淋巴細胞主要行使Tc細胞的功能，因此根據CD 4+T淋巴細胞和CD 8+T淋巴細胞的數量，可初步評估機體免疫狀態。研究表明，惡性血液病患者機體免疫功能失衡導致機體免疫力下降，抗腫瘤能力減弱，T淋巴細胞亞群的檢測可以為惡性血液病的診斷、治療及判斷預后提供依據[8]。另有研究顯示[9]細胞免疫與白血病的發生、發展及轉歸有關。本研究結果回示：ALL患兒初診組及緩解組外周血CD 3+T淋巴細胞、CD 4+T淋巴細胞的表達水平均低于對照組(P<0.05)，而CD 8+T淋巴細胞的表達水平高于對照組(P<0.05)，初診組與緩解組之間的比較差異有統計學意義(P<0.05)，提示ALL患兒存在不同程度的免疫異常，與文獻報告一致。

細胞因子介導的細胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要方式。大量研究表明細胞因子網絡失衡是腫瘤細胞能夠免疫逃逸的機制之一，與兒童白血病相關的細胞因子有干擾素調節因子-3(IRF-3)、腫瘤壞死因子a(TNF-a)、干擾素(IFN)和Toll樣受體(TLR)等[6]。IL-17是一種具有多種生物學效應的細胞因子，主要由Th 17細胞產生，可以誘導產生多種細胞因子、趨化因子、炎癥效應物質和抗微生物蛋白，從而參與多種自身免疫性疾病和感染炎癥[10]。近年來，發現IL-17與腫瘤的關系密切。一方面IL-17可以通過誘導腫瘤的血管生成等來發揮促瘤效應；另一方面它又可以通過增強NK細胞、細胞毒性T細胞的活性來發揮抗腫瘤效應[11]。Th 17的表達根據不同的腫瘤類型而有差異。如在肺腫瘤中發現IL-17有效促進非小細胞肺癌細胞的生長和增殖，對肺癌調節性T細胞的免疫反應具有抑制作用[12]。在白血病患兒中的研究中發現[13]Th 17的表達低于對照組，且未緩解組更低。分析其原因可能為：(1)白血病細胞可能分泌一些抑制Th 17功能的因子，未緩解時體內腫瘤負荷高，抑制作用更強。(2)白血病患者由于經過化療或放療，機體免疫系統遭到破壞，因此，初始T細胞數量減少，其所分化的Th 17當然更少。(3)機體還存在一些抑制Th 17細胞的細胞亞群，如Th 1和調節性T細胞等，當白血病經過化療達到緩解時，雖然Th 17的功能有所恢復，但這些抑制Th 17的細胞功能也有所恢復，綜合作用的結果就是抵消了Th 17數量和功能的提高[14]。本研究結果回示：ALL患兒初診組及緩解組外周血IL-17的水平均低于對照組(P<0.05)，提示IL-17可能參與了ALL患兒的發生發展。

IL-35屬于IL-12家族，是一種由p 35和EBI 3亞基組成的異源二聚體分子,主要來源于Tregs并為其發揮最大免疫抑制功能所必需，從而在誘導和維持機體免疫耐受過程中發揮了重要作用[15-16]。目前研究認為IL-35可能廣泛參與了體內的免疫應答過程，不僅在細胞內感染及炎癥過程中起著重要的調節作用，而且與自身免疫病和腫瘤等多種臨床疾病的發生、發展密切相關，成為細胞因子研究的新熱點[17]。研究發現[18]，IL-35在AML患者體內高表達，分析原因可能為：IL-35通過抑制效應性T細胞(effector T cells,Teffs)和促進Tregs/iTr 35(IL-35誘導的調節性T細胞)的表達和功能以及直接促進AML細胞的增殖和抑制AML細胞的凋亡來誘導AML細胞的免疫逃逸，從而在介導AML的發生發展中具有重要作用。但在ALL中的發病機制目前不完全明確。本研究發現：ALL患兒初診組及緩解組外周血IL-35的水平均高于對照組(P<0.05)，提示IL-35可能也參與了ALL患兒的發病過程。

綜上所述，本研究表明，ALL患兒存在不同程度的免疫異常，外周血中IL-17的表達水平降低、IL-35的表達水平升高，且CD 4+T淋巴細胞的表達水平與IL-17的水平呈正相關，與IL-35的水平呈負相關，提示免疫異常、IL-17的低表達及IL-35的高表達可能參與了ALL的發生發展，但兩兩之間是否具有一定的因果關系，需要更加深入的研究。

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Objective The study was to detect the levels of IL-17 and IL-35 and the expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood, to explore its role in the pathogenesis of acute lymphoblastic leukemia (ALL). Methods One hundred and forty-one cases with ALL were divided into two groups: Group A (n=76) who were confirmedly diagnosed but not yet treated; Group B (n=65) who were confirmedly diagnosed and treated systematically with chemotherapy; and 45 healthy children were selected as the control group. Flow cytometry (FCM) was used to measure the expression of T lymphocyte subsets, and the levels of IL-17 and IL-35 were determined with enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA). Results The level of IL-17 in Group A and Group B was significantly lower than that in control group (P<0.05). On the contrary, the level of IL-35 in Group A and Group B was significantly higher than that in control group (P<0.05). The expressions of CD 3+T and CD 4+T cells in Group A and Group B were significantly lower than those in control group (P<0.05),and the CD 8+T cells level increased significantly (P<0.05), significant difference was found between Group A and Group B (P<0.05). The expression of CD 4+T cells was positively correlated with the level of IL-17 (r=0.678,P<0.01), but negatively correlated with the level of IL-35 (r=-0.688,P<0.01). Conclusion There are immune disorders of varying degrees in ALL children, and the expression of IL-17 and IL-35 in peripheral blood may paly an important role in the pathogenesis of ALL.

Acute lymphocytic leukemia; Interleukin-17; Interleukin-35; T lymphocyte subsets; Child

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.2.003

河南 450052 鄭州大學第三附屬醫院小兒血液/腫瘤科 （王西閣 張曉敏 趙雪蓮 周玉潔 任瑞芳）