紅樹植物角果木屬的分子系統發育研究

朱春超，談鳳笑，劉瑩，強寅夢，施蘇華，黃椰林（.中山大學　生命科學學院　廣東省植物資源重點實驗室，廣東　廣州　5075；.華南農業大學　資源環境學院，廣東　廣州　5064）

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紅樹植物角果木屬的分子系統發育研究

朱春超1，談鳳笑2，劉瑩1，強寅夢1，施蘇華1，黃椰林1
（1.中山大學生命科學學院廣東省植物資源重點實驗室，廣東廣州510275；2.華南農業大學資源環境學院，廣東廣州510642）

摘要：運用PCR產物直接測序法測定了紅樹科（Rhizophoraceae）角果木屬（Ceriops）5個物種24個個體加上外類群木欖共125個序列，包括rpl20-rps12，atpB-rbcL，trnL intron，trnL-trnF，trnT（UGU）-trnL（UAA）共5段葉綠體非編碼區，序列總長度為2716 bp。基于以上合并序列，采用最大簡約法、貝葉斯法和鄰接法所構建的系統發育樹呈現出高度一致的系統發育關系，結果顯示：角果木屬包含兩個大的分支：（1）角果木C. tagal和澳洲角果木C. australis構成一個分支；（2）十雄角果木復合體內的3個物種（十雄角果木C. decandra、齊氏角果木C. zippeliana和擬十雄角果木C. pseudodecandra）組成另一分支，其中齊氏角果木和擬十雄角果木為姊妹種，該分支3個物種相互之間的遺傳距離均顯著大于傳統物種角果木和澳洲角果木之間的遺傳距離，并且每個物種的單系性在系統樹上均得到強烈支持。研究結果支持了Sheue在最近研究中關于該屬物種地位的處理，進一步探討了角果木屬系統發育關系與該屬生物地理分布模式之間的相關性。

關鍵詞：紅樹植物；角果木屬；分子系統發育

紅樹科（Rhizophoraceae）角果木屬（Ceriops）是熱帶亞熱帶海岸紅樹林植物類群中的重要樹種，是以印度-西太平洋地區為分布中心的代表性真紅樹植物。該屬植物葉片呈光滑偏黃綠色，故被稱為“yellow mangrove”（Tomlinson，1986）；傳統上該屬分為3種：十雄角果木C. decandra、角果木C. tagal、澳洲角果木C. australis，其中以角果木和十雄角果木分布最廣，其分布范圍從非洲東岸、馬達加斯加向東經熱帶亞洲和澳大利亞直至美拉尼西亞（Tomlinson，1986）；澳洲角果木分布范圍很窄，僅限于澳大利亞、新幾內亞及其鄰近島嶼。中國僅有角果木1種，其南部沿海是該種世界分布的北緣（Duke，1992）。最新的調查表明其分布范圍由原來的廣西、海南、廣東直至臺灣南部縮減為僅有的海南、廣東兩省（陳小勇等，2000；梁士楚，2000；王文卿等，2007）。近年來，隨著印度西太平洋地區海岸紅樹植物實地調查的不斷深入和植物材料的重新整理和審視，角果木屬的系統發育研究有了新的進展，有研究顯示傳統上所認為的十雄角果木可能為一個物種復合體（species complex），能進一步根據形態特征劃分為3個物種（十雄角果木C. decandra，齊氏角果木C. zippeliana，擬十雄角果木C. pseudodecandra）（Sheue et al，2009a；Sheue et al，2010）。但這種物種劃分尚未得到進一步的驗證，各物種之間的關系也存在矛盾和疑問（Tsai et al，2012）。此外，該屬植物物種之間形態差異相對較小，各種性狀往往相互交叉，種間界限難以區分，分類和鑒定非常困難。因此利用新的證據進一步的開展角果木屬的系統發育研究無疑是該屬研究的重要方向。

隨著分子生物學技術的發展，合理的分子標記被認為能較為客觀地提供植物類群中的系統發育信息并解決形態特征上的趨同進化干擾。其中葉綠體基因組中的內含子和基因間隔區因為均屬非編碼序列，進化速率快，常被用于探討屬間或屬下類群的系統發育關系。常用的葉綠體非編碼區域包括rpl20-rps12，atpB-rbcL，trnLintron，trnL-trnF，trnT （UGU）-trnL（UAA）等。本研究旨在利用上述序列探討角果木屬植物種間親緣關系，構建系統發育樹，并為相關物種的界定提供分子水平上的證據。

1　材料和方法

1.1實驗材料

本研究所用植物材料包括角果木屬24個個體，按Sheue等（2010）的形態特征描述分別屬于5個不同的物種（表1），并基于前人的研究結果（Huang et al，2008）采用木欖作為本研究的外類群。采樣時間跨度為2004-2013年，系本文作者所在實驗室在多年的針對印度-西太平洋沿岸地區各種紅樹植物的實地采樣過程中不斷采集得到。角果木屬內每種植物均包含3-6個分布在不同地理群體里的個體，目的是初步估計并比較物種內的遺傳多態性水平。野外采集時將所采植物的新鮮葉片材料用硅膠快速干燥，帶回實驗室干燥柜中儲存備用。憑證標本存于中山大學標本館。

1.2 DNA提取

采用CTAB法提取總DNA（Doyle et al，1987）。所提樣品DNA均存放在零下八十度超低溫冰箱凍存。

1.3葉綠體序列的擴增、純化及測序

葉綠體片段PCR擴增的引物來自Taberlet等（1991），Hodges等（1994）和Hamilton（1999）。反應體系為20 μl，包括DNA 20-40 ng，引物0.15 μmol/L，MgCl221.5 mol/L，dNTP 0.1 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 U。擴增程序為：94℃，5 min→94℃，45 s→56℃，50 S→72℃，80 s→32個循環→72℃，6 min。PCR產物經瓊脂糖電泳檢測后直接測序，測序引物與PCR反應引物相同，采用雙向測序。

1.4序列分析和系統樹的構建

所測序列經人工校正后提交至GenBank（登錄號見表1，所有125個序列均為本研究所測），進一步采用Clustal X 1.8軟件進行排序和格式轉換后，采用PAUP（Phylogenetic Analysis Using Parsimony）Version 4.0進行最大簡約法（Maximum Parsimony，MP）構樹，空位（gap）處理為缺失狀態。采用啟發式搜尋，TBR枝長交換以及500次隨機序列加入尋找最大簡約樹。采用自展分析（bootstrap）檢驗簡約樹中各分支的置信度，自展數據集為1 000次。貝葉斯樹（Bayesian inference，BI）的構建則采用Mrbayes V3.0 b4軟件包完成。在構樹前先采用Modeltest V 3.06獲取最佳核苷酸替代模型，并估計相關參數。貝葉斯法所用Markov Chain Monte Carlo（馬爾可夫鏈蒙特卡洛，MCMC）參數如下：以隨機樹為起始樹，number of generations（代數）= 1000000，number of chains（鏈數）= 4，sample frequency（取樣頻率）= 100，MCMC達到平衡后，舍棄老化樣本數（burnin）占總數的25%，系統樹各分支的置信度以后驗概率（Posterior Probability，PP）的形式來體現。此外，應用MEGA（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）Version 5來計算種間遺傳距離以及種內的遺傳多態性水平，遺傳距離模型選擇Kimura 2-parameter模型，并進行鄰接法構樹（Neighbor-Joining，NJ）。NJ樹同樣采用自展值檢驗分支的置信度，自展數據集為1000次。

表1　實驗材料來源及GenBank序列號

表2　基于5個葉綠體非編碼區合并序列的角果木屬物種間遺傳距離和種內多態性

2　結果

所分析樣品的5個葉綠體非編碼區段的序列矩陣經Clustal X 1.8排列后總長為2716 bp。由于葉綠體在遺傳上是作為一個整體（單倍型）。因此，我們將同一樣品的所有5個葉綠體非編碼區段的序列數據合并進行分析，以最大程度獲取系統發育的信息。利用Kimura 2-parameter模型計算得到的物種間的遺傳距離見表2，角果木屬植物間的遺傳距離介于0.003～0.027，遺傳距離最近的兩個物種是角果木與澳洲角果木（0.003），遺傳距離最遠的兩個物種是角果木（澳洲角果木）與十雄角果木C. decandra之間（均為0.027）。十雄角果木物種復合體所包含的3個物種相互之間的遺傳距離介于0.010～0.019之間，均大于角果木與澳洲角果木之間的遺傳距離。物種內的遺傳多態性檢測結果見表2，分析結果表明5個物種的遺傳多樣性水平均較低。角果木、澳洲角果木與擬十雄角果木沒有檢測到多態性，而十雄角果木C. decandra和齊氏角果木C. zippeliana的種內多態性水平均為千分之一。

最大簡約分析共有109個信息位點，采用啟發式搜尋最終得到26棵最簡約樹，步長為183，一致性指數（CI）和維持性指數（RI）分別為0.956 和0.986。圖2為其嚴格一致樹并給出了重復1000次計算所得到的各分支的Bootstrap值。應用Modeltest進行模型選擇所選的最適替代模型為GTR + G，由該程序所獲得的替代模型參數運用在下一步的貝葉斯構樹分析中。貝葉斯法構建系統發育樹的結果見圖3，各分支的后驗概率值（PP）也同時列出。比較最大簡約法、貝葉斯法和鄰接法（未列出）的系統發育結果發現，3種方法所分別構建的系統發育樹在拓撲結構上高度一致，角果木屬植物均分為兩個大的分支：（1）角果木和澳洲角果木構成一個分支；（2）屬內其余植物，即十雄角果木復合體內的3個物種組成另一分支，該分支中齊氏角果木和擬十雄角果木為姊妹種，而十雄角果木與兩者的關系相對較遠（圖2，3），在分支的支持率上，屬內各物種的對應分支均得到極高的支持，其單系性均得到驗證。

3　討論

角果木屬作為紅樹科海岸紅樹林植物4屬之一，具有典型的紅樹植物形態特征，例如胎萌和發達的根系等等，以適應于海岸潮間帶生境（Tomlinson，1986）。但該屬的系統發育和分類研究則一直存在爭議。Hou（1958）認為該屬存在兩個種：十雄角果木C. decandra（Griff.）Ding Hou和角果木C. tagal（Perr.）C. B. Robinson。White （1926）和Tomlinson（1996）則進一步在澳大利亞、新幾內亞及其鄰近島嶼鑒定出一個新的變種C. tagal（Perr.）C. B. Rob. var. australis C. T. White。Ballment等（1988）通過進一步的等位酶分析，將該亞種由亞種地位上升為種，命名為澳洲角果木C. australis（C. T. White）E. R. Ballment，T. J. Smith & J. A. Stoddart。目前澳洲角果木的種的地位已得到較多研究結果的支持（Duke，2006；Huang et al，2008；Sheue et al，2009b）。在形態特征上，角果木與澳洲角果木非常相似，最顯著的區別在于胎生苗（胚軸）的形態，前者的胎生苗有棱角，而后者為圓柱狀（Sheue et al，2009b）。本研究的分子系統發育研究結果同樣支持了角果木與澳洲角果木各自的單系類群地位（100%支持率，圖2，3），以及兩種之間的姊妹群關系。這兩個種組成了角果木屬的第一大分支（100%支持率）。另外值得注意的是，本研究中的6個角果木個體分別來自不同地理區域的群體（包括東印度洋沿岸，西太平洋沿岸和澳大利亞），在一定程度上反映了角果木的分布范圍。而種內多態性分析的結果表明，角果木作為該屬分布最廣的種，與分布區狹窄的澳洲角果木相比其種內多樣性水平卻都接近于零（表2），盡管這只是基于少數個體水平上的初步估計，但這一結果同樣印證了Huang等（2012）對角果木群體遺傳研究的結果，表明該物種存在一定程度上的遺傳瓶頸效應。

圖1　角果木屬物種和外類群的樣品地理分布圖

圖2　基于葉綠體合并序列的角果木屬最大簡約樹（MP）

圖3　基于葉綠體合并序列的角果木屬貝葉斯樹（BI）

在本研究的分子系統發育樹中角果木屬的第2大分支對應著傳統意義上的角果木屬的第3個種：十雄角果木C. decandra（Griff.）Ding Hou。其支持率也達到了100%。但該分支進一步分化成3個亞分支；分別對應著3個經重新界定和命名的物種（Sheue et al，2010）：這3個種的重新界定和命名主要是基于形態學上的考量。Sheue等（2009a；2010）在印度西太平洋地區海岸紅樹植物實地調查過程中對角果木屬的植物材料進行了重新整理審視，認為基于萼筒形狀，花瓣被毛特征和花的數目等特征可以把傳統意義上的十雄角果木劃分為3個種，十雄角果木C. decandra（Griff.）Ding Hou，齊氏角果木C. zippeliana Blume和擬十雄角果木C. pseudodecandra Sheue，Liu，Tsai & Yang。具體來說，十雄角果木的花萼呈現半球型，5～9 mm高；子葉下胚軸長8～13 cm、寬0.5～0.7 cm，頂端較圓。而齊氏角果木的花萼則呈較淺的圓盤型，2-3mm高；子葉下胚軸長9～17 cm、寬0.7～0.8 cm，頂端尖銳。擬十雄角果木花萼也是半球形，高度介于十雄角果木和齊氏角果木之間，4～5 mm；子葉下胚軸長10～16 cm、寬0.5～0.8 cm，頂端極其尖銳（Sheue et al，2010）。但在進一步的實地采樣中發現這些特征上的差異仍然相對較小，各種性狀往往相互交叉。因此利用分子序列上的證據來進一步驗證這些物種是非常有必要的，盡管在劃分這些物種時，Sheue等（2009a；2010）也采用了分子數據，但均基于一個基因片段，分辨率和可靠性存在疑問，也沒有足夠的支持率回答這3個種哪兩個為姊妹種的問題。現在重建的分子系統發育樹基于5個葉綠體分子片段，其所蘊含的分子系統發育信息非常清晰的將這3個種分開成獨立的3個分支，其中齊氏角果木和擬十雄角果木為姊妹種。而且這些分支之間的遺傳距離取值都在0.010以上，均大于兩個廣泛接受的物種即角果木與澳洲角果木之間的遺傳距離0.003，這進一步支持了這些分支所代表的種的物種地位。

將本研究所獲得分子系統發育樹與各物種現有的地理分布相結合，會發現該復合體中存在一個明顯的生物地理模式：即異域式物種形成模式。在印度-西太平洋地區，由于紅樹植物（尤其是紅樹科植物）的胎生苗是通過海洋進行傳播的，因此普遍認為該地區由于海平面升降所形成的幾處陸地障礙會影響紅樹植物的分化乃至物種形成（Huang et al，2008；Benzie et al，1998；Benzie et al，1999；Liao et al，2007）。其中馬來半島和印度尼西亞群島作為歷史上在該地區曾出現的基因流地理障礙對該地區的紅樹植物的遺傳分化可能有著顯著的影響（Huang et al，2008；Tan et al，2005）。在本研究中所揭示的分子系統發育樹中，十雄角果木，齊氏角果木和擬十雄角果木這3個種的地理分布恰好對應著這兩個歷史地理障礙所分割的區域：十雄角果木的分布范圍是印度，孟加拉，緬甸和泰國西海岸；齊氏角果木的分布范圍大致是馬來半島東岸和南岸，南中國海周邊，菲律賓，以及印尼的北部和中部地區；擬十雄角果木的分布范圍限于澳大利亞，巴布亞新幾內亞和印尼的南部部分地區（Sheue et al，2010）。這一分布模式暗示著由歷史上的幾次隔離分化事件驅動了相應的物種形成，并且進一步可由在系統樹上3個物種的系統發育關系推論出馬來半島所引起的隔離分化事件相對更早。歷史上，由馬來半島所引起的異域式物種形成在該地區已有記錄和研究（Tomlinson，1986）。例如紅樹植物阿吉木屬Aegialitis的一個種A. annulata僅分布在馬來半島的印度洋一側，而它的姊妹種A. rotundifolia則分布在馬來半島的太平洋一側（Duke，2006）。是否該地區有更多的紅樹植物具有類似的物種形成模式？同時，本屬另一個廣泛分布的物種（角果木）為何在這些區域之間沒有顯著的遺傳隔離模式？對這些問題的探索是進一步研究的方向，而采用多基因的序列在統計學意義上進行物種界定與物種形成分析的研究是回答這些問題所必需的，進一步的研究正在進行中。

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（本文編輯：李曉光）

Molecular phylogeny of mangrove genus Ceriops（Rhizophoraceae）

ZHU Chun-chao1，TAN Feng-xiao2，LIU Ying1，QIANG Yin-meng1，SHI Su-hua1，HUANG Ye-lin1
（1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Resources，School of Life Sciences，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510275，China；2. South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

Abstract：Five non-coding regions of chloroplast，including rpl20-rps12，atpB-rbcL，trnL intron，trnL-trnF and trnT （UGU）-trnL（UAA），from 24 individuals of five species in Ceriops and one outgroup species Bruguiera gymnorrhiza in Rhizophoraceae were determined by sequencing their PCR products directly. All 125 sequences of the five non-coding regions from different species were aligned and resulted in 2716 bp. The maximum parsimony，Bayesian inference and neighbor-joining methods were adopted to reconstruct molecular phylogeny of Ceriops based on the combined sequences，respectively. All phylogenetic trees showed consistent topology which revealed two clades in Ceriops，including one clade consisting of C. tagal and C. australis，and the other clade corresponding to C. decandra complex（C. decandra，C. pseudodecandraand C. zippeliana）. The pairwise genetic distances among species of C. decandracomplex were significantly higher than those between two well-recognized species C. tagal and C. australis. And the monophyly of different species and the sistership of C. pseudodecandraand C. zippelianawere well supported. Our result supported Sheue's recent studies on the treatment of these species status in Ceriops. The article further discussed the association between the molecular phylogeny and the biogeographical model in Ceriops.

Keywords：mangrove；Ceriops；molecular phylogeny

中圖分類號：P735；Q941

文獻標識碼：A

文章編號：1001-6932（2016）02-0209-07

Doi：10.11840/j.issn.1001-6392.2016.02.012

收稿日期：2015-01-25；

修訂日期：2015-06-30

基金項目：國家自然科學基金（41276107；31200466；J1210074；J1310025）；廣東省自然科學基金（2015A030313136）。

作者簡介：朱春超（1986-），女，博士研究生，主要從事分子生態學研究。電子郵箱：zhuchunchao11@163.com。

通訊作者：黃椰林，博士，副教授。主要從事紅樹植物分子生態與群體遺傳研究。電子郵箱：lsshyl@mail.sysu.edu.cn。