毛尖茶葉中脂氧合酶活性測定方法的建立

吳桂玲+吳艷玲+劉品禎

摘要：采用紫外分光光度法，以亞油酸鈉為反應底物，研究毛尖茶葉中的脂氧合酶（LOX）的酶活性測定方法。結果表明，毛尖茶葉中的脂氧合酶的最適pH值為6.3，最適溫度為50 ℃，在底物300 μL時酶活性最好，且有較好的熱穩定性，60 ℃保溫1 h后仍具有一定活性。

關鍵詞：毛尖茶葉；脂氧合酶（LOX）；活性

中圖分類號： S571.101

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0331-03

都勻毛尖別稱“白毛尖”“細毛尖”“魚鉤茶”“雀舌茶”，是中國十大名茶之一，產于貴州省都勻市，都均市屬貴州省黔南州布依族苗族自治區。都勻毛尖主要產于牛場、白芒、團山一帶，這里山谷起伏，峽谷溪流，冬無嚴寒，夏無酷暑，四季怡人，年均氣溫16 ℃，年均降水量1 400 mm。加上土層深厚，泥土疏松濕潤，土質是酸性或微酸性，內含大量鐵質和磷酸鹽，這些特殊的自然條件不僅適宜茶樹的生長，而且也形成了都勻毛尖的獨特風格，都勻毛尖因獨特的芳香氣味而備受青睞[1]。目前分離得到的與茶葉芳香氣味有關的物質主要是一些小分子的醇、醛、脂類物質，在茶葉中這些小分子物質主要是由脂氧合酶、脂氫過氧化物裂解酶聯合催化產生，其中脂氧合酶是關鍵酶[2]。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12）別稱脂肪氧化酶、脂氧酶、脂肪加氧酶、脂肪氧合酶（LOX），是一種含非血紅素鐵的加氧酶，專一催化具有順、順-1，4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸及其相應的脂，通過對其分子加氧，形成具有共軛雙鍵的脂氫過氧化物（hydroperoxides，HPOD）[3]。在茶葉中HPOD進一步被脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）催化，從而生成各種揮發性的脂類物質，即茶葉芳香味的來源。因此，研究茶葉中脂氧合酶的活性，以及建立一個簡便、準確、重現性好的LOX活性測定體系可為茶葉芳香氣味形成生理的基礎研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料茶樹鮮葉采自貴州省都勻市白芒；亞油酸（Sigma 公司生產，純度為99. 9%）；吐溫20；麥氏緩沖溶液（pH值為6.3，0.1 mol/L 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液）。其他化學試劑均為分析純，試驗用水為實驗室自制去離子水。

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；PHS-2C精密pH計，上海理達儀器廠；HH-S型數顯恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司；GTR21-1 高速冷凍離心機，上海趙迪生物科技有限公司；電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司。

1.3 反應底物的制備

參照Axelord等的方法[4]，略作修改后具體操作如下：將0.25 mL 吐溫20分散于10 mL、pH值為9.0的0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液中，搖動下逐滴加入0.27 mL亞油酸，充分混合，再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液使體系澄清，并調pH值至90，然后用上述緩沖液稀釋到500 mL作為底物。

1.4 粗酶液（LOX）的提取

將鮮茶葉洗凈晾干，粉碎，稱取10 g加入200 mL pH值為6.3的麥氏緩沖溶液，勻漿2 min，過濾，濾液在4 ℃時高速離心5 min，取上清液，加入固體硫酸銨至30%飽和度，放入冰箱4 h后取出，高速離心5 min后取上清液，加入固體硫酸銨至70%飽和度，在冰箱中過夜，取出高速離心10 min，取沉淀加入15 mL麥氏緩沖溶液溶解，得到粗酶液。

1.5 脂氧合酶（LOX）活性的測定

參照Axelrod等的方法[4]，略作修改后具體操作如下，取亞油酸鈉母液50 μL，緩沖液2 750 μL，粗酶液0.2 mL，配成3 mL 反應體系。在室溫25 ℃下反應，測定234 nm處的吸光度（D）。反應1 min時記錄1個數據，反應5 min時再記錄1個數據，觀察2個時間D值的變化。重復3次。酶活性以ΔD234 nm/（g·min）來表示。酶活計算公式：

1.6 毛尖茶葉中LOX酶最適pH值的測定

在不同的pH值條件（pH值=6.0～7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值=7.5～8.0磷酸鹽緩沖液，pH值=8.0～9.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，緩沖液的濃度均為0.1 mol/L）下，在3 mL反應體系中依次加入麥氏緩沖液2 750 μL、亞油酸鈉母液50 μL、粗酶液0.2 mL，加入后立即準確計時，反應1 min時測1個吸光度值，待反應5 min后再測1個吸光度值，酶活性同樣以ΔD234 nm/（g·min）來表示。重復3次，以LOX活性最大時的酶反應的pH值作為毛尖茶葉LOX的最適pH值。

1.7 毛尖茶葉中LOX酶最適溫度的測定

將1支空試管置于不同溫度（10、20、30、40、50、60、70、80 ℃）的恒溫水浴中，于試管中依次加入麥氏緩沖液（pH值=6.3，0.1 mol/L）2 750 μL、亞油酸鈉母液50 μL、粗酶液0.2 mL。加入后立即準確計時，反應1 min時測1個吸光度值，待反應5 min后再測1個吸光度值，酶活性以ΔD234 nm/（g·min）來表示。重復3次，以LOX活性最大時的酶反應溫度作為毛尖茶葉LOX的最適溫度。

1.8 毛尖茶葉LOX酶反應最適底物濃度的測定

在50 ℃、pH值為6.3時，在不同底物濃度下反應，測定LOX酶活性。測定體系基本同“1.5”節，在3 mL反應體系中分別加入底物亞油酸鈉母液25、50、100、150、200、250、300、350、400 μL，通過調節所加緩沖溶液的體積來保證最終3 mL體系不變。

1.9 毛尖茶葉LOX酶的熱穩定性研究

在pH值為6.3時，在不同溫度（30～80 ℃）下處理LOX粗酶液3 min，測定其吸光度值，然后再用相應的溫度處理1 h后，立即置于冰上，降至室溫（15 ℃）下測定酶保持的活力，測定體系同“1.5”節。

2 結果與分析

2.1 毛尖茶葉LOX酶的最適pH值

由圖1可見，毛尖茶葉LOX活性有2個活性峰，其中pH值=6.3時活性最高；另外在堿性范圍（pH值=7.5附近）也有1個小峰，但很不明顯，其LOX活性遠低于pH值=6.3時的活性峰。類似茶葉脂氧合酶的這種情況在其他物種中也有。如側耳（Pleurotus ostreatus）中的LOX在pH值=8.0處有最大活性，在pH值=4.5處也有1個較小的峰[5]；念珠地絲菌（Geotrichum candidum）中的LOX在pH值=3.75和pH值=8.0處顯示了最大活性[6]；桃果實中的LOX在pH值=4.5和pH值=6.0處有最大活性[7]；尼羅羅非魚（Tilapia nilotica）中鰓組織的LOX在pH值=10.0和4.0處也有最大活性[8]。對于植物中LOX活性最適pH值的研究也有報道，如甜玉米的最適pH值為6.0[9]；獼猴桃為5.0～5.5[7]；花生種子為5.8和8.0[10]；水稻為7.6[11]；荔枝果實為6.5[12]；番茄為6.0左右，黃瓜為7.0左右，甜瓜為 7.0，青蘋果為65[13-14]。對于茶葉中LOX的最適pH值也有報道，如陳宗道等研究發現茶樹中LOX的最適pH值為6.2[15]，而本研究的毛尖茶葉的最適pH值為6.3，與其相差不大。因此毛尖茶葉中LOX活性的最適pH值為6.3，在堿性范圍（pH值=75）附近也有1個較小的活性峰。

2.2 毛尖茶葉LOX酶的最適溫度

由圖2可見，在10～20 ℃時LOX活性呈緩慢上升趨勢，20～30 ℃時緩慢下降，在30～50 ℃時急劇上升，至50 ℃時達到最大值，50 ℃后開始急劇下降。有關其他物種LOX活性最適溫度的報道有大豆LOX最適溫度18 ℃[16]；花生種子脂氧合酶的最適反應溫度為35 ℃[10]；黃瓜果實脂氧合酶的最適溫度為40 ℃[13]；對于植物來源的香蕉葉片LOX最適溫度為40 ℃[17]；水產動物羅非魚鰓組織中脂氧合酶的最適溫度為30 ℃[8]；而陳宗道等的研究結果表明茶樹中LOX的最適溫度為40 ℃[15]。而本研究的毛尖茶葉LOX最適溫度為50 ℃。

2.3 毛尖茶葉LOX酶反應最適底物濃度的測定

由圖3可見，在3 mL反應體系中加入300 μL底物亞油酸鈉母液時測得的酶活性最大。在低濃度范圍內，酶反應速度隨底物體積增加而增加，當底物體積增加到一定值后，酶活性卻下降，這可能是由于底物亞油酸與LOX反應過程中，也有一部分在空氣中自動氧化為羥基過氧化物，而當生成的羥基過氧化物達到一定濃度時，就會引起LOX自我失活[6]。

2.4 毛尖茶葉LOX酶的熱穩定性

由圖4可見，本試驗采用紫外分光光度法測定LOX酶活性的原理實質是測定LOX反應產物脂氫過氧化物HPOD的增加速率，因為HPOD在234 nm處有光吸收。毛尖茶葉LOX對熱相對穩定，在50 ℃時活性最高，即使60 ℃處理1 h，酶仍表現出一定的活性。用70 ℃處理1 h后，酶已經失活，因此活性迅速下降。

3 結論

本研究通過對毛尖茶葉中脂氧合酶（LOX）活性影響因素即最適溫度、最適pH值的研究，從而確立了一個適合毛尖茶葉LOX活性測定的體系，即毛尖茶葉經粉碎機粉碎后，取10 g毛尖茶葉加200 mL的麥氏緩沖溶液溶解并過濾，將上清液用高速冷凍離心機離心（12 000 r/min，5 min），上清液加（NH4）2SO4 30%飽和度，冰箱中4 h后繼續離心（12 000 r/min，5 min），于上清液中加（NH4）2SO4 70%飽和度，冰箱中過夜，再繼續離心（15 000 r/min，10 min）后棄去上清液并加15 mL的麥氏緩沖液溶解沉淀，搖勻后用于LOX活性測定。在3 mL的反應體系中加入pH值為6.3的麥氏緩沖液2 500 μL、亞油酸鈉母液300 μL、粗酶液0.2 mL。在 50 ℃ 反應1 min時記錄1個數據，到5 min時再記錄1個數據，于234 nm處測定LOX的活性，記錄D234 nm值的變化，酶活性以ΔD234 nm/（g·min）來表示。茶葉中脂氧合酶有著較好的熱穩定性，60 ℃保溫1 h后仍具有一定的活性，50 ℃保溫1 h可能對該酶的活性有激活作用。通過對茶葉中脂氧合酶活性測定體系的確定，為進一步探討都勻毛尖茶獨特香味的形成機理、改良毛尖茶葉的品質提供理論基礎。

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