川木瓜多糖的提取及醇沉工藝研究

李容+覃福禮+呂佳窈+尹建華

摘要：為研究川木瓜多糖的提取和醇沉工藝，以多糖得率為提取工藝指標(biāo)，沉降率為醇沉工藝指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，分別研究川木瓜多糖的提取和醇沉工藝。結(jié)果表明，川木瓜多糖的最佳提取工藝為：超聲預(yù)處理50 min，料液比1 g ∶20 mL，浸提溫度100 ℃，浸提時(shí)間2.0 h，多糖得率可達(dá)4%以上；多糖醇沉的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，乙醇用量5倍，醇沉?xí)r間20 h，沉降率可達(dá)90%以上。

關(guān)鍵詞：川木瓜；多糖；提取工藝；醇沉工藝；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： TQ353.6；R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0328-03

川木瓜為皺皮木瓜（Chaenomeles speciosa）的一個(gè)品種，是一種藥食兼用的資源，在食用上，可用來制作果脯、罐頭、果醋、果酒等產(chǎn)品[1]；在醫(yī)學(xué)上用作中藥材，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效，主治風(fēng)濕痹痛、肢體酸重、筋脈拘攣、吐瀉轉(zhuǎn)筋、腳氣水腫等癥[2]。川木瓜化學(xué)成分復(fù)雜，含有多糖、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、三萜、黃酮、皂苷、氨基酸等多種活性成分[3]。植物多糖為一類天然高分子物質(zhì)，研究表明天然多糖具有抗氧化、降血糖、抗腫瘤、抗病毒等作用[4]，成為食品及醫(yī)藥行業(yè)的研究熱點(diǎn)之一，引起人們的高度關(guān)注。多糖為川木瓜主要的主要化學(xué)成分之一。熱水浸提法是常規(guī)的多糖提取方法，其方法簡(jiǎn)單、成本低、無污染，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但提取率相對(duì)較低[5]。超聲波提取法利用空化和機(jī)械振動(dòng)作用破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)[6-7]，使提取液易于滲入細(xì)胞內(nèi)部，加速多糖溶解，提高多糖提取效率。本試驗(yàn)先用超聲波預(yù)處理原料粉末，再用熱水浸提川木瓜多糖，優(yōu)化多糖提取工藝；在提取的基礎(chǔ)上，再對(duì)多糖醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高效的提取分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

川木瓜采自廣西壯族自治區(qū)百色市凌云縣隴浩村，將所采鮮果洗凈、切片、去籽、晾干、粉碎過篩備用。

試驗(yàn)試劑主要有：石油醚、苯酚、無水乙醇、乙醚、濃硫酸均為分析純；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（上海雅吉生物科技有限公司）。

主要儀器有：CPA64型電子天平；HHS-21-4電熱式恒溫水浴鍋；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；TU-1800紫外-可見分光光度計(jì)；FZ102植物粉碎機(jī)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；3-18K離心機(jī)；KQ5200超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 多糖提取與醇沉方法 取川木瓜粉末，加入1.5倍體積石油醚回流4 h，過濾、揮發(fā)干石油醚，脫去脂溶性成分。精確稱取脫脂后的川木瓜粉末，加入一定體積蒸餾水，先超聲處理，再置水浴鍋浸提，減壓過濾，定容，得多糖提取液，測(cè)定多糖含量。將多糖提取液按一定比例進(jìn)行濃縮，加入一定體積95%乙醇，常溫下靜置一段時(shí)間，離心分離，去掉上清液得多糖沉淀，將多糖沉淀復(fù)溶于水，定容，測(cè)醇沉后多糖含量。

1.2.2 川木瓜多糖的含量測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用硫酸-苯酚法[8-9]測(cè)定川木瓜多糖含量。精確稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，用雙蒸水溶解定容至100 mL，配制成濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0.0、0. 5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于50 mL容量瓶中，定容得一系列對(duì)照品溶液。分別吸取對(duì)照品溶液2 mL于具塞試管中，依次加入5.0%重蒸苯酚溶液1.00 mL，搖勻，加入濃硫酸5.0 mL，在沸水浴加熱5 min，室溫靜置10 min，測(cè)定490 nm處的吸光度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程y=12.24x-0.003，r2=0.998，線性范圍為0.01～0.05 mg/mL。

1.2.2.2 多糖含量測(cè)定 將提取或醇沉所得的多糖溶液均濃縮、定容至100 mL，取待測(cè)液2 mL稀釋至50 mL，取稀釋后的溶液2 mL于具塞試管中，按“1.2.2.1”節(jié)的方法測(cè)定多糖含量。

1.2.2.3 多糖得率與收率計(jì)算

1.2.3 多糖提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗(yàn) 稱取10.0 g處理后的川木瓜粉末5份，在料液比為1 g ∶20 mL，水浴提取溫度90 ℃，水浴提取時(shí)間1.5 h的固定條件下，改變超聲波時(shí)間20、30、40、50、60 min，考察超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。按料液比（g ∶mL）1 ∶10、1 ∶15、l ∶20、1 ∶25、1 ∶30加入蒸餾水，超聲時(shí)間40 min，浸提溫度90 ℃，提取時(shí)間1.5 h，考察料液比對(duì)多糖得率的影響。在料液比為1 g ∶20 mL，超聲時(shí)間40 min，提取時(shí)間1.5 h的固定條件下，改變浸提溫度60、70、80、90、100 ℃，考察浸提溫度對(duì)多糖得率的影響。在料液比為1 g ∶20 mL，超聲時(shí)間40 min，提取溫度90 ℃的固定條件下，改變浸提時(shí)間0.5、1、1.5、2、2.5 h，考察浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

1.2.3.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲波處理時(shí)間、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間為考察因素，以多糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化川木瓜多糖提取工藝。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)置見表1。

1.2.4 多糖醇沉工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素試驗(yàn) 取5份等體積的多糖提取液，分別加入4倍用量體積分?jǐn)?shù)分別為55、65、75、85、95%的乙醇，在室溫下沉降10 h，考察濃縮比對(duì)多糖沉降率的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，醇沉?xí)r間為10 h，改變乙醇用量1、2、3、4、5倍，考察乙醇用量對(duì)多糖沉降率的影響。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%，乙醇用量為4倍，改變醇沉?xí)r間5、10、15、20、25 h，考察醇沉?xí)r間對(duì)多糖沉降率的影響。

1.2.4.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇用量、醇沉?xí)r間為考察因素，以多糖沉降率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化多糖醇沉工藝。因素水平設(shè)置見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖提取工藝結(jié)果

2.1.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1.1 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取的影響 由圖1可知多糖得率與超聲時(shí)間呈正相關(guān)性，超聲時(shí)間超過40 min后得率增加幅度較小。超聲時(shí)間長(zhǎng)有利于原料藥材細(xì)胞破壁，多糖溶出。綜合考慮提取效果與超聲能耗，選取40 min為超聲前處理時(shí)間。

2.1.1.2 料液比對(duì)多糖提取的影響 由圖2可知，料液比（g ∶mL）在（1 ∶10）～（1 ∶20） 范圍內(nèi)多糖得率呈上升趨勢(shì)，達(dá) 1 ∶20 時(shí)得率最高，（1 ∶20）～（1 ∶30）呈緩慢下降趨勢(shì)。提取溶劑少使藥材與溶劑接觸不充分，多糖得率低；提取溶劑太多，會(huì)增加后期濃縮的困難，故料液比為1 ∶20比較適宜。

2.1.1.3 浸提溫度對(duì)多糖提取的影響 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響如圖3所示，由圖3可知，在提取溫度為60～90 ℃多糖得率隨著提取溫度升高而增加，90 ℃后提取率略下降。提取溫度低，溶劑的滲透力差，多糖的溶解度小，不利于有效成分的溶出；溫度過高可能會(huì)導(dǎo)致多糖降解，提取率反而降低[10]。因此，提取溫度90 ℃時(shí)為宜。

2.1.1.4 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取的影響 從圖4可知，多糖得率隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增加，隨后又略有下降，提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，多糖得率達(dá)最大值。提取時(shí)間太短不利于多糖的溶出，時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間高溫，多糖被破壞。因此，提取時(shí)間選取1.5 h。

2.1.2 正交試驗(yàn) 正交試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從表3分析可知，提取川木瓜多糖各因素對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)锽>D>A>C，即料液比>浸提時(shí)間> 超聲時(shí)間>浸提溫度；最優(yōu)水平是A2B2C3D3，即提取多糖的最佳工藝為：超聲時(shí)間 50 min，料液比1 g ∶20 mL，浸提溫度100 ℃，浸提時(shí)間2.0 h。

2.1.3 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 取川木瓜粉末5份，每份10 g，

2.2 醇沉工藝結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖醇沉的影響 從圖5可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)醇沉率影響較大，最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為85%。多糖分子量分布較廣，分子量與溶解性密切相關(guān)，不同分子量的多糖在乙醇中的溶出特性不同，在醇沉中會(huì)造成不同程度的損失。

2.2.1.2 乙醇用量對(duì)多糖醇沉的影響 從圖6可知，多糖的沉降率隨著乙醇用量的增加而增加，當(dāng)乙醇用量為濃縮液的4倍時(shí)沉降率達(dá)最高大值，最佳的乙醇用量為4倍體積。

2.2.1.3 醇沉?xí)r間對(duì)多糖醇沉的影響 從圖7可知，延長(zhǎng)時(shí)間有利于多糖沉降，當(dāng)沉降時(shí)間為10 h時(shí)多糖沉降率達(dá)85%，10 h后沉降率呈緩慢上升趨勢(shì)，因此，沉降時(shí)間為10 h合適。

2.2.2 正交試驗(yàn) 醇沉工藝正交試驗(yàn)和直觀分析結(jié)果如表4所示。從表4分析可知，各因素對(duì)多糖醇沉率的影響順序?yàn)锽>A>C，即乙醇用量>乙醇濃度> 醇沉?xí)r間；最優(yōu)水平是A2B3C2，即醇沉多糖的最佳工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)85%，乙醇用量5倍，醇沉?xí)r間20 h。

3 討論

天然活性多糖的提取和純化方法對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)與生理活性有著重要的影響，如何高效地提取和純化多糖是多糖研究的基礎(chǔ)[11]。常見的多糖提取方法主要有溶劑提取法、超聲波提取法、酶解法、微波提取法和超臨界提取法，幾種提取方法各有利弊，將幾種方法聯(lián)合使用可以明顯提高提取效率。本試驗(yàn)將超聲波與傳統(tǒng)的水提法聯(lián)合提取多糖，多糖得率可達(dá)4%以上。乙醇沉淀多糖的原理為利用乙醇降低多糖溶液的介電常數(shù)，破壞多糖分子的水膜，從而增加多糖分子間的相互作用，導(dǎo)致多糖溶解度降低而沉淀[12]。通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化醇沉工藝，其沉降率可達(dá)90%以上；但在多糖醇沉過

程中大分子蛋白質(zhì)、核酸等可能也會(huì)隨之沉淀，后期應(yīng)進(jìn)一步除去非糖組分，純化多糖，獲得高純度的活性多糖。

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