適合銀杏葉發酵的菌株篩選及發酵效果

林標聲+吳江文+江火香+戴愛玲+楊小燕

摘要：研究了適合銀杏葉發酵的菌株及其發酵效果。結果表明，銀杏葉添加濃度為40%～50%時，地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產朊假絲酵母適合用于銀杏葉發酵，其最佳的比例混合為2 ∶1 ∶1，最優的發酵工藝條件為接種量5%，含水量50%、發酵時間15 d，發酵溫度30 ℃，與發酵前物料相比，發酵后銀杏葉制劑菌株大量生長，產生乳酸，粗蛋白、氨基酸含量顯著上升，提高了產品的益生菌含量、適口性及營養成分。

關鍵詞：銀杏葉；發酵菌株；篩選；地衣芽孢桿菌；嗜熱乳桿菌；產朊假絲酵母

中圖分類號： S182

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0315-03

銀杏（Ginkgo biloba L.）是世界上最古老的孑遺植物，為中國特有珍稀樹種，分布廣泛，資源豐富。銀杏的藥用價值主要體現在葉和果實上，我國宋朝時民間就使用銀杏葉治療哮喘和支氣管炎[1]等疾病。自20世紀60年代起，國內外學者對銀杏葉的化學成分、藥理作用、藥物功效等進行了大量的相關研究，結果表明，銀杏葉化學成分復雜，種類較多，許多成分具有重要的生理功能及活性[2]。到目前為止，從銀杏葉中分離出的化學活性成分有160余種，包括銀杏黃酮類、有機酸類、萜內酯類、烷基酚酸類、銀杏酚類、醇類及甾類等[3]。銀杏葉的食用安全性也較高，目前，以銀杏葉及提取物為原料的藥物和保健食品等已經大量上市。特別是近年來銀杏葉作為飼料添加劑，在畜禽飼養方面有了一定的運用，能起到促進畜禽腸胃吸收、促生長、增強免疫力等功效，其作為一種新型飼料添加劑在畜牧業中具有廣闊的開發應用前景[4-5]。銀杏葉的相關開發，主要以銀杏葉提取物為主，但銀杏葉提取物的傳統溶劑浸提法既造成了大量有效成分的損失，也無法保證產品的純天然性[6]。而利用微生物發酵銀杏葉制成微生物發酵劑，既克服了傳統方法的缺點，又使銀杏葉功效成分得到更好的直接釋放[7]。從國內外資料調查可知，銀杏葉在畜牧業上的應用還很少，特別是將銀杏葉微生物發酵劑開發及作為飼料添加劑在生豬中的應用還未見報道，可能是銀杏葉制劑的相關成分對微生物有一定的抑制作用，限制了銀杏葉發酵制劑的研制與開發[8-9]。因此，本研究以銀杏葉為發酵基質，通過篩選適合銀杏葉發酵的優良菌株，優化其配伍組合，考察其發酵效果，為將來進一步開發出操作易行、裝置簡易且成本低廉、營養豐富、適口性好的銀杏葉發酵制劑產品提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏葉購自市場，在60 ℃烘干后粉碎，過20目篩備用，裝入自封袋密封保存。

初始菌株來源：市場購買的各畜用復合微生物發酵劑凍干菌粉（包括酵母菌，雙歧桿菌、嗜熱乳桿菌，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等），各有效菌活性乳酸菌含量≥20億/g。

1.2 方法

1.2.1 銀杏葉發酵的整體工藝流程

1.2.2 銀杏葉發酵發酵菌株的篩選 銀杏葉發酵液與發酵菌株培養基的配制：將銀杏葉粉碎后，過篩40～50目，短時瞬間高溫蒸煮，配制出濃度為300～600 mg/mL溶液加入到適合各菌生長的培養基中，作為篩選培養基。

分別取1 g復合菌劑于9 mL無菌水中，振蕩15 ～20 min 后，適當稀釋。分別取0.1 ～0.2 mL稀釋液于篩選培養基中，酵母菌采用YPD培養基，乳酸菌采用MRS培養基，芽孢桿菌采用菌液60 ℃加熱15～20 min 后涂布于LB培養基中。培養觀察不同濃度銀杏葉條件下各菌長勢，挑選生長旺盛、形態完整的菌株作為選定菌株。經形態、顯微、生理生化鑒定，最終確定適合銀杏葉發酵的微生物菌株類型及屬性。

1.2.3 發酵菌株最適合菌株配比、接種量的篩選 將所篩選的各菌均培養至10億～100億個/mL，各均按設定的比例取量混合，總菌量再按物料總量4%～5%的比例接入到35～37 ℃ 溫水中攪拌、活化20～30 min，溫水中含總發酵物料 80～100 mg/mL 紅糖。菌株活化后，與銀杏葉450～480 mg/mL、硫酸銨40～50 mg/mL、維生素C 1～2 mg/mL，硫酸鉀 1～2 mg/mL混合均勻，并補充水分至450 mg/mL，用裝量1～2 kg呼吸膜包裝、密封，常溫（25 ℃）生料發酵12 d，發酵后檢測各項指標，選定最合適的菌株組合比例。各菌比例及接種量按表L827正交試驗表安排進行。

1.2.4 銀杏葉發酵工藝條件的優化 將所篩選的各菌均培養至10億～100億個/mL，按照選定的最優組合的發酵菌株比例及接種量加入35～37 ℃溫水攪拌、活化20～30min，溫水中含總發酵物料80～100 mg/mL紅糖。菌株活化后，與銀杏葉450～480 mg/mL、硫酸銨40～50 mg/mL，維生素C 1～2 mg/mL，硫酸鉀1～2 mg/mL混合均勻，并補充水分至400～500 mg/mL，用裝量1～2 kg呼吸膜包裝、密封，常溫（20～35 ℃）生料發酵10～15 d。發酵物料含水量、發酵溫度及發酵時間是銀杏葉發酵效果的重要因素，試驗采用L934正交表進行優化試驗。

1.2.5 銀杏葉發酵效果的評價 在選定的最優工藝條件下發酵銀杏葉，對其進行感官評定及營養分析，并與發酵前物料成分進行對比分析，分析銀杏葉發酵后各指標的變化情況。

1.2.6 測定分析方法 pH值采用上海雷磁儀器廠生產的PHS-25型酸度計測定；乳酸含量采用南京建成乳酸檢測試劑盒測定；纖維采用酸堿消煮法測定；黃酮采用蕓香苷比色法測定；蛋白凱氏定氮法測定；總氨基含量采用 S433D 全自動氨基酸測定。各檢測方法參照國家飼料檢測分析標準進行[10]。

2 結果與分析

2.1 發酵菌株的篩選及鑒定

不同濃度銀杏葉條件下，所接各菌的長勢情況見表1，結果表明，不同類型的培養基中，銀杏葉濃度越高，其對菌株的抑制作用越強。為了充分利用銀杏葉中的營養成分，綜合考慮選定銀杏葉添加濃度40%～50%時，并從中篩選生長旺盛、長勢良好、形態結構完整的菌落進行擴培、鑒定[11]，結果見表2，選定的菌株鑒定為地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產朊假絲酵母。

2.2 發酵菌株最適合菌株配比、接種量

發酵菌株最適合菌株配比、接種量的試驗結果見表3。結果表明，地衣芽孢桿菌生長最為旺盛，生長快，當其比例多時，微生物總菌數也多。當微生物總菌數高時，各菌聯合作用，銀杏葉基質利用較多，所得蛋白含量、產生的乳酸含量也較高，為了便于提高工作效率，選定總菌數為篩選指標參考依據，按正交試驗結果，選定的最優組合為A2B1C1D2，即地衣芽孢桿菌 ∶嗜熱乳桿菌 ∶產朊假絲酵母=2 ∶1 ∶1，接種量5%，此條件下各菌生長旺盛，乳酸含量較多，粗蛋白和多肽含量也較高。

2.3 發酵工藝條件的優化

銀杏葉發酵工藝條件的優化結果見表4、表5，結果表明，最佳的制備工藝條件為A3B3C2，即含水量50%、發酵時間 15 d、發酵溫度30 ℃，其中發酵物料含水量對發酵過程影響最大，達到極顯著水平。

2.4 銀杏葉發酵效果評價

銀杏葉發酵后與發酵前的營養成分進行對比分析，結果見表6。結果表明，發酵后復合菌株大量生長，嗜熱乳桿菌產生了乳酸的香味，并且地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母將銀杏葉中的纖維、黃酮分解，使其發酵物質中的粗蛋白、氨基酸含量顯著上升，提高了產品的益生菌含量、適口性及營養成分。

3 結論與討論

通過含不同濃度銀杏葉的篩選培養基得到適合銀杏葉發酵的微生物菌株，通過鑒定確認為地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產朊假絲酵母，并通過正交試驗，優化得到了適合銀杏葉發酵的最佳工藝條件為：地衣芽孢桿菌、嗜熱乳桿菌、產朊假絲酵母以2 ∶1 ∶1比例混合，接種量按總發酵物料5%接種，含水量50%、發酵時間15 d，發酵溫度30 ℃，與發酵前物料相比，發酵后復合菌株大量生長，嗜熱乳桿菌產生了乳酸的香味，并且地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母將銀杏葉中的纖維、黃酮分解，使其發酵物質中的粗蛋白、氨基酸含量顯著上升，提高了產品的益生菌含量、適口性及營養成分。

銀杏葉發酵制劑的研制國內報道較少，本研究采用多菌聯合發酵銀杏葉是一個開創性的工作，各益生菌相互作用，對銀杏葉中的基質能更好地利用，所得營養物質更為豐富，這對銀杏葉制劑的推廣應用具有更好的現實作用[12-13]。而對銀杏葉發酵制劑產品的實際開發、使用對象、使用效果等有待于進一步研究闡明。

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