鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞DNA損傷的比較研究

何蕾+王璐+惠秀娟+劉宛+宋婕+徐成斌+王鶴潼

摘要：通過彗星試驗比較研究了鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞的DNA損傷。設置6個不同劑量組（陰性對照組、7.5、15、30、60、120 mg/kg組）對小鼠進行30 h 灌胃方式染毒，末次染毒 6 h 后小鼠頸椎脫臼處死。檢測小鼠肝、脾、腎細胞的彗星細胞率、彗星尾長及尾矩。結果表明：（1）鹽酸小檗堿可引起上述3種受試器官的DNA損傷，且隨劑量增加，DNA損傷增加（P<0.05），呈顯著的劑量-效應關系。（2）比較同劑量組不同器官之間的彗星細胞率、彗星尾長及彗星尾矩，3個劑量組均為腎細胞>脾細胞>肝細胞，并存在器官間顯著差異（P<0.05）。一定劑量鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞造成了DNA損傷，具有一定的遺傳毒性，比較研究發現腎細胞對鹽酸小檗堿致DNA損傷最為敏感。

關鍵詞：鹽酸小檗堿；DNA損傷；彗星試驗；小鼠

中圖分類號： X171.5

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0305-03

鹽酸小檗堿又稱黃連素，是苯并異喹啉類銨型生物堿[1]，以清熱解毒和抗菌等療效著稱，在臨床上作為廣譜抗菌類藥物已使用多年。鹽酸小檗堿還具有降血糖、抗心律失常、抗腫瘤、免疫調節等多種藥理活性[2-3]。鹽酸小檗堿也表現出一定的毒副作用，研究表明大鼠大腦中遺傳物質的合成、細胞內細胞呼吸鏈相關酶的正常運轉、大腦皮質神經元死亡、小腦顆粒神經元死亡，這些都受到侵入細胞內的鹽酸小檗堿的影響[4]。鹽酸小檗堿還被大劑量地添加在動物飼料中，由于過量使用不能被完全吸收代謝，大部分仍會以原藥或次級代謝產物的形式隨動物糞便排泄出體外，污染地下水及環境，對于人類以及整個環境都造成巨大的危害。

單細胞凝膠電泳技術（SCGE），又稱彗星試驗，SCGE在1984年首次由Ostling等[5]提出，是一種在細胞層面上準確檢測DNA損傷的方法，應用于很多領域[6]。Guengerich等[7]應用彗星試驗探究了常見和不常見的細胞色素P450代謝和毒性的相關化學反應；Knut等[8]通過彗星試驗檢測了紫外線引起的DNA損傷，近幾年，Kliemann等[9]，Djelic等[10]應用SCGE技術探究了人類和動物細胞的DNA損傷。但目前為止，利用彗星試驗比較鹽酸小檗堿對不同器官DNA損傷差異的研究尚未見報道。因此，為了研究大劑量鹽酸小檗堿的遺傳毒性及其潛在的環境影響，本研究從細胞和分子水平上，探究鹽酸小檗堿對于小鼠不同器官的遺傳毒性。通過彗星試驗檢測鹽酸小檗堿誘發小鼠不同器官彗星細胞率、彗星尾長及彗星尾矩的變化情況，為進一步探究鹽酸小檗堿的遺傳毒性、毒性機理等提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理

采用ICR雄性小鼠（沈陽醫學院實驗動物中心）36只，體質量25～30 g，使用SAS隨機程序將實驗動物分為6組：陰性對照組、7.5、15、30、60、120 mg/kg組。灌胃方式采用30 h灌胃法，末次染毒 6 h 后小鼠頸椎脫臼處死。所有處理均重復 6次。

1.2 主要試驗試劑

鹽酸小檗堿（分析純）、溴化乙錠 （EB）、過氧化氫（H2O2）均購自國藥集團化學試劑沈陽有限公司；正常熔點瓊脂糖（NMA）、低熔點瓊脂糖（LMA）、二甲亞砜（DM-SO）、及硫代巴比妥酸等購自美國 Sigma 公司，試劑均為優級純。

1.3 試驗步驟

參照Singh 等改進和建立的單細胞凝膠電泳技術[11]，并進行改良。

1.3.1 細胞懸液的制備 試驗小鼠常規喂養2周后，稱質量，頸椎脫臼處死取出肝臟、脾和腎臟，用4 ℃的磷酸緩沖液（PBS）沖洗浮血，濾紙粘去表面液體后稱質量、計數。將上述組織剪成糜狀，加適量冰冷的PBS溶液，壓濾后通過200目不銹鋼篩網過濾，收集細胞懸液，用D-Hanks溶液調整，使細胞濃度保持106～107個/mL，于4 ℃保存待用。

1.3.2 染毒 參照鹽酸小檗堿對小鼠的急性經口LD50為763.5 mg/kg，設定鹽酸小檗堿染毒劑量組：7.5、15、30 mg/kg。

1.3.3 制膠片 分3 層：底層為正常熔點瓊脂糖層，中間層為含細胞懸液的低熔點瓊脂糖層，第3 層為低熔點瓊脂糖凝膠層。其中每個試驗劑量組制作3張膠片作為平行樣。

1.3.4 細胞裂解 取出制好的膠片移去蓋玻片，將載玻片橫向浸入新配制的4 ℃細胞裂解液1.5 h。裂解結束后用4 ℃PBS緩沖溶液進行漂洗。

1.3.5 DNA堿解旋 將載玻片按首尾相連的順序浸入新配制的堿性電泳緩沖液，液體沒過所有載玻片250 mm，15 ℃條件下，避光解旋40 min。

1.3.6 電泳 恒定電壓25 V、電流300 mA，避光電泳20 min。

1.3.7 中和 將載物片淹沒于Tris-HCl （pH值=75） 15 min。

1.3.8 染色與觀察 避光條件下，50 μL EB染色15 min，放置于倒置式熒光顯微鏡下進行鏡檢。用515～560 nm 的激發光觀察，每個樣本在200倍下隨機選擇50 個彗星圖像，用 CASP（Comet Assay Software Project）圖像分析軟件測量尾長和尾矩。

1.4 統計學處理

用 Excel 2007軟件整理試驗數據，用SPSS 20.0軟件進行顯著性檢驗和方差分析，計算彗星試驗彗星細胞率、尾長、尾矩的平均值和標準偏差，同時進行Tukey HSD 多重比較。

2 結果與分析

2.1 鹽酸小檗堿影響小鼠肝、脾、腎細胞的彗星細胞率

彗星試驗檢測鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞的彗星細胞率的結果見表1。由表1可知，小鼠肝、脾、腎3種細胞所有劑量組同陰性對照組比較，其彗星細胞率顯著增加（P<005）。3種細胞劑量組的彗星細胞率依次是陰性對照組的5.2～20.3、6.8～9.1、9.2～11倍，說明鹽酸小檗堿對小鼠的肝、脾、腎細胞均造成了DNA損傷，且損傷程度隨劑量組變化。

2.2 鹽酸小檗堿影響小鼠肝、脾、腎細胞的彗星尾長

彗星試驗檢測鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞的彗星尾長影響的結果見圖1。當鹽酸小檗堿染毒劑量為15 mg/kg時，小鼠各器官彗星尾長即顯著性增加（P<0.05），且隨著濃度的增加，受試器官尾長均呈現不同程度加大，DNA 損傷加劇，說明鹽酸小檗堿對小鼠的肝、脾、腎細胞均造成了DNA損傷，且隨著鹽酸小檗堿劑量的增加，小鼠肝、脾、腎3種器官彗星尾長都加大，呈現明顯劑量-效應關系。

2.3 鹽酸小檗堿影響小鼠肝、脾、腎細胞的彗星尾矩

圖2顯示了不同濃度鹽酸小檗堿染毒后小鼠彗星尾矩的影響。尾矩（tail moment）[12]為尾部中遺傳物質DNA所占的含量百分比與尾長數據相乘得到的結果，可以更全面、準確考察DNA損傷程度。由圖2可知，鹽酸小檗堿在3個染毒劑量作用下，均對小鼠肝、脾、腎細胞有一定的DNA損傷。在最小劑量7.5 mg/kg時，小鼠各器官細胞尾矩與陰性對照組相比有顯著差異（P<0.05）。且隨鹽酸小檗堿濃度的增高，小鼠細胞DNA損傷程度逐漸增加，呈劑量-效應關系。同時，通過試驗前細胞活性的檢測可知，在沒染毒之前，腎臟細胞、肝臟細胞和脾細胞的存活率均在95%以上，染毒后細胞存活率也達到90%以上，屬于可以使用范疇，說明DNA損傷為鹽酸小檗堿與陽性對照組作用所致，而非細胞毒性造成細胞失活引起的損傷。

3 討論

彗星試驗能夠有效測定各種不同類型細胞的DNA損傷，國際上通常使用彗星尾部DNA含量、彗星尾長和彗星尾矩等指標來評價細胞的DNA損傷[6，13-14]。在遺傳毒理學、放射生物學、腫瘤疾病治療等眾多領域，彗星試驗都得到了廣泛應用[15-16，5]。本研究檢測了不同劑量鹽酸小檗堿處理后小鼠肝、脾、腎細胞的尾長、尾矩以及彗星細胞率。試驗結果表明，鹽酸小檗堿可引起受試器官（肝、脾、腎）的DNA損傷，且有顯著的劑量效應關系（P<0.05）。高賽燕等應用彗星試驗檢測溴蟲腈農藥的普通制劑、納米制劑、納米功能化制劑對小鼠淋巴細胞的DNA損傷，發現溴蟲腈制劑處理組DNA損傷的指標與對照組之間差異顯著（P<0.05）[17]。王璐等研究表明鹽酸小檗堿濃度增加，小鼠脾細胞尾長、尾矩以及彗星細胞率等指標顯著增加，DNA損傷加劇[18]。導致這種結果的原因可能是：伴隨染毒劑量增大，DNA損傷加劇，雙螺旋結構逐漸不穩定并開始斷裂，小片段越來越多，指示尾部DNA含量和尾長等指標變化。但對于鹽酸小檗堿長期染毒條件下小鼠小鼠肝、脾、腎細胞尾長、尾矩以及彗星細胞率的變化情況還需要進一步探究，相關的試驗正在進行中。

鹽酸小檗堿對不同臟器引起的DNA損傷程度不同：當鹽酸小檗堿為最小染毒劑量7.5 mg/kg時，全部受試器官尾長、尾矩以及彗星細胞率均比對照組顯著增加（P<0.05），尤其是腎細胞增加更為顯著，各臟器DNA損傷程度，從大至小的順序：腎細胞>脾細胞>肝細胞。這一結果與Hosseinzadeh等的結果[19]一致。據此認為腎是最敏感的器官，脾細胞次之，肝細胞受損最輕。由于腎臟本身特殊的生理結構和功能，使其成為藥物不良作用的主要靶器官[20]，原因如下：（1）腎臟血流量大，內部毛細血管網豐富，進入腎臟的藥量大且接觸面積大。（2）腎髓質大量耗氧導致其對腎毒性高度敏感。同時，腎髓質的滲透梯度可濃縮尿液，使得藥物及其代謝產物濃度增加，損傷顯著加大。（3）腎臟內的部分酶類可將藥物代謝為毒性物質；腎臟的酸化功能也容易導致藥物沉淀析出[21]。

綜上所述，研究鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞DNA損傷影響的彗星試驗中，彗星細胞率、尾長和尾矩3個指標表現出良好的關聯性，能夠有效地證明鹽酸小檗堿對小鼠肝、脾、腎細胞的DNA損傷，同時得知腎細胞對鹽酸小檗堿致DNA損傷最為敏感。本試驗結果為鹽酸小檗堿遺傳毒性的進一步研究以及后續機理研究提供了相關依據。

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