豬圓環病毒2型泰州株的分離鑒定

郭廣富+曹軍平+朱愛萍+金彩蓮+戴麗紅+陶宏衛

摘要：2011年9月，泰州某豬場暴發疑似斷奶仔豬多系統衰竭綜合征傳染性疾病。采集發病豬腹股溝淋巴結、脾臟和肺臟組織，研磨成組織混懸液，經PCR檢測、陽性產物測序，陽性病料懸液經0.22 μm濾膜過濾后接種PK15細胞，連續盲傳5代后收取細胞病毒液并提取DNA，PCR檢測及間接免疫熒光鑒定，結果表明，該分離株為豬圓環病毒2型（PCV2），命名為TAIZ110926株，目標序列提交給NCBI，獲得了序列號：KF039888。

關鍵詞：豬圓環病毒2型；分離；鑒定；目標序列

中圖分類號： S858.285.3

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0294-02

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）是迄今為止發現的一種最小的動物病毒，具有豬圓環病毒1型（PCV1）和豬圓環病毒2型（PCV2）2種基因型。PCV2感染豬群能引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎和腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）及懷孕母豬繁殖障礙（sow abortion and mortality syndrome，SAMS）等[1]。血清學和病原學調查證實，PCV2呈世界性分布，給養豬業造成了巨大的經濟損失[2-3]。本研究通過對泰州市某豬場疑似PMWS患豬采集肺臟及淋巴結等組織病料進行PCV2的分離、鑒定，以期為今后深入研究和科學防控該病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

疑似斷奶仔豬多系統衰竭綜合征豬的腹股溝淋巴結、脾臟和肺臟等組織，于2011年9月26日采自泰州市某豬場。無PCV污染的PK15由江蘇省動物流行病學研究中心保存。基因組DNA快速抽提試劑盒（動物）、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、25 mmol/L MgCl2及10×PCR buffer均為上海生工生物工程有限公司產品，100 bp DNA Ladder和6×DNA 凝膠載入染料（Loading Dye）購自Fermentas公司。豬源抗PCV2陽性血清，購自VMRD公司；羊抗豬IgG-FITC，購自SANTN CRUZ公司。胰酶細胞消化液，購自上海碧云天生物技術有限公司；新生牛血清和DMEM培養基購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 引物的設計與合成

根據文獻[4]的方法，合成1對PCV2引物，片段針對PCV2 ORF2基因中的一段序列，長487 bp。引物序列為上游引物：5′-CTgTTTTCgAACgCAgTgCC-3′；下游引物：5′-gCATCTTCAACACCCgCCT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 病料處理

將采集的脾臟、淋巴結和肺等病變組織，研磨研碎，按1 ∶5 加入無菌含雙抗的PBS溶液，混勻，反復凍融3次，離心取上清，用孔徑0.22 μm濾器過濾后，-20 ℃保存備用。

1.4 病料的PCR檢測和測序

用基因組DNA快速抽提試劑盒，按說明書上的操作方法提取組織病料DNA。以提取的組織病料DNA為模板進行PCR擴增，PCR采用50 μL反應體系：5 μL 10×buffer、3 μL 25 mmol/L MgCl2、1 μL 10 mmol/L dNTPs、20 μmol/L上下游引物各1 μL，用滅菌超純水補足50 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察電泳圖譜，拍照記錄結果。

PCR產物的回收和純化：PCR產物電泳后，按Agrose Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）說明書進行，回收純化預期大小的靶片段。

PCR產物的克隆、鑒定、序列測定：取3.2 μL回收純化產物與pGEM-T easy vector載體（Promega）4 ℃過夜連接。連接產物轉化至DH5α感受態細胞，在IPTG+X-gal+Amp的LB平板上篩選白斑，常規方法小量提取質粒。質粒初步電泳驗證后，進行PCR鑒定。選擇陽性克隆，送南京Genscript公司在ABI 3720 DNA測序儀上測序：T7和SP6或M13+和M13-雙向測序。

基因序列比對：采用Lasergene 7.1版（DNASTAR Inc.，Madison，WI，USA）進行序列的拼接編輯；使用NCBI網站提供的BLAST程序，查找同源率最高的核苷酸序列以進行驗證。

1.5 病毒的分離培養

將上述“1.3”節處理的經PCR檢測呈PCV2陽性的病料懸液接種于長至半融合狀態的PK15細胞上，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗滌2次，加入維持液于37 ℃、5%CO2培養箱中培養72 h，收集細胞反復凍融3次后，取上清繼續在PK15細胞上盲傳5代。

1.6 病毒的間接免疫熒光鑒定

將第5代分離株接種于長滿單層的PK15細胞，37 ℃孵育1 h后，吸取病毒液，PBS洗滌2次，加入維持液于37 ℃、5%CO2培養箱中培養72 h；同時以未接種病毒的PK15細胞作為陰性對照。待檢細胞使用PBS洗滌3次，冰甲醇室溫固定30 min；PBS洗滌3次，加入PCV2一抗（豬PCV2陽性血清），37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3次，再加入FITC標記的羊抗豬二抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，置于Olympus倒置熒光顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 病料的PCR檢測和測序

對疑似PCV2感染豬組織病料提取DNA，進行PCR檢測，擴增出片段大小為487bp的目的條帶，與預期的結果相符（圖1）。

將圖1所示靶片段回收純化連接測序，獲得了預期大小487 bp的序列，提交給NCBI，獲得了序列號：KF039888。通過BLAST，發現本研究所測毒株序列與GenBank中Porcine circovirus 2 isolate PCV-Y21 （KC515013）的核苷酸同源性最高（99.8%），說明它們的相關基因起源可能相同。

2.2 病毒的分離培養

接種病料的PK15細胞培養72 h無細胞病變，而且盲傳5代也沒有出現。

2.3 細胞培養物的PCR檢測

第5代細胞毒液抽提DNA后經PCR檢測，能夠擴增出487 bp大小的特異性片段（圖2）。

2.4 病毒的間接免疫熒光鑒定

在細胞培養物中觀察到了典型的特異性綠色熒光，未接種PCV2病毒的PK15細胞沒有觀察到任何特異性熒光。結果表明，該分離株為PCV2。將分離的PCV2命名為TAIZ110926株（圖3、圖4）。

3 結論與討論

PCV2主要侵害機體的免疫系統，造成免疫抑制、免疫能力下降，從而有利于其他病原體的并發或繼發感染。PCV2在世界范圍內廣泛流行，給養豬業造成了巨大的經濟損失。我國是一個養豬大國，因而對該病病原的深入研究具有非常重要的意義。

感染豬的許多組織（如淋巴結、脾臟、肺臟、腎臟或肝臟）內含有PCV2病毒粒子，可采用細胞培養的方法分離該病毒。PK15細胞是目前用于PCV2病毒分離的主要細胞系。由于PCV2在PK15細胞上雖能生長，但不產生細胞病變，因而需要結合其他方法來確認PCV2的存在。一般借助PCR、間接免疫熒光試驗或電子顯微鏡觀察，以確認病毒分離結果。

本試驗將PCR檢測后PCV2陽性的病料經研磨、過濾，接種PK15細胞，連續盲傳5代后進行PCR檢測及間接免疫熒光鑒定，結果成功分離出泰州株PCV2。該毒株的獲得，為今后深入研究該病毒的分子生物學特性及開發有效的免疫制劑提供了科學的參考依據。

參考文獻：

[1] Grau-Roma L，Fraile L，Segales J.Recent advances in the epidemiology，diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2 [J]. Vet，2011，187（1）：23-32.

[2]Gillespie J，Opriessnig T，Meng X J，et al. Porcine circovirus type 2 and porcine circovirus-associated disease [J]. J Vet Intern Med，2009，23（6）：1151-1163.

[3]Opriessnig T，Meng X J，Halbur P G. Porcine circoviruses type 2 associated disease：update on current terminology，clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis，and intervention strategies [J]. J Vet Diagn Investig，2007，19：591-615.

[4]胡 慧，賈艷艷，楊春華，等. 多重PCR檢測豬偽狂犬病毒、豬細小病毒和豬圓環病毒2型的研究[J]. 河南農業大學學報，2010，44（4）：421-424.高 峰， 房興堂，顧斐翠. 三合激素、甲睪酮對雛雞雞冠及內臟器官發育的影響[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：296-298.