外源一氧化氮NO對鐵皮石斛類原球莖生長及多糖積累的影響

蔣天儀+卓宇+唐敏+王波

摘要：通過添加不同濃度的一氧化氮（NO）供體硝普鈉（SNP）處理鐵皮石斛類原球莖，研究外源NO對鐵皮石斛類原球莖生長發育、多糖合成的影響。結果表明：低濃度SNP有利于鐵皮石斛類原球莖生長和多糖含量的提高，而高濃度的SNP則表現出抑制作用。綜合看來，0.5 mmol/L SNP效果最佳，其中干質量比對照組高36.90%，葉綠素a含量提高了17.81%，葉綠素b含量提高了12.17%，總葉綠素含量提高了14.91%，多糖產量提高了51.22%；NO專一性猝滅劑cPITO抑制了SNP的這種促進作用，說明NO參與了鐵皮石斛類原球莖生長和多糖合成的調控，從而影響其生長發育和次生代謝產物的合成。

關鍵詞：鐵皮石斛；類原球莖；一氧化氮；硝普鈉；多糖；葉綠素a；葉綠素b；總葉綠素

中圖分類號： S567.23+9.04

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0257-03

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，是我國傳統名貴藥材，具有增強免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖和養陰生津等多種生物活性[1]。現代研究表明，多糖是鐵皮石斛的主要化學成分[2]，其水溶性多糖含量高達22.7%[3]，石斛生理活性的強弱與其多糖含量密切相關。此外，鐵皮石斛也具有一定的觀賞價值，其花色艷麗，可作為一種小型盆栽觀賞[4]。但是由于鐵皮石斛生長條件的特殊性和分布的局限性，又經過長期采挖，導致其自然資源瀕臨枯竭，國內市場供應緊缺。近年來，鐵皮石斛的組織培養技術已經很成熟，組織培養從細胞到微苗、幼苗、壯苗，雖然縮短了自然生長周期，但是最短也要1～2年時間[5]，其優質種苗的來源和供應已經成為制約鐵皮石斛生產發展的“瓶頸”。何鐵光等研究證明，鐵皮石斛類原球莖的多糖含量與野生品相近，且其藥理作用相同，從而證明可以直接培養類原球莖來代替全植株提取藥源[6]。

NO作為氣體信號分子，參與植物的多種生理代謝過程。樊洪泓等用外源NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）處理霍山石斛發現，NO可以提高光合系統的光能轉換效率和潛在活性[7]。隨后金青等研究表明，外源NO促進了雜交石斛類原球莖中生物堿的合成與積累[8]。周永斌等用不同濃度的SNP處理豌豆、黃瓜、玉米、刺槐種子及其砂培幼苗時發現，一定濃度的SNP對種子發芽勢、發芽率及幼苗的根長、葉綠素含量和生物量有明顯的促進作用[9]。后來劉建新等也發現，適宜濃度的SNP可促進黑麥草種子的發芽率、幼苗干物質積累速率及葉綠素含量的提高[10]。Modolo等以NO處理大豆，發現外源NO可以提高大豆組織中黃酮、異黃酮類物質的含量[11]。徐茂軍也有類似研究報道，外源NO對紫杉醇的生物合成具有促進作用[12]。以上研究表明，外源NO能夠促進植物的生長，并對植物次生代謝產物的合成具有一定作用。

本試驗通過外源NO對鐵皮石斛類原球莖的處理，探討對其生長發育及多糖積累的影響，并試圖尋找適宜的外源NO濃度來增加鐵皮石斛類原球莖的產量和藥用成分含量。從而利用鐵皮石斛類原球莖生產目的產物，縮短周期，降低成本，提高生產效率，滿足市場需求，為提高鐵皮石斛的藥用工廠化生產可行性提供一定的實踐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料是從云南西雙版納藥用植物研究所引進的鐵皮石斛無菌苗。鐵皮石斛類原球莖由無菌苗莖段誘導而來，經過30～40次繼代培養，每30 d繼代1次，具有穩定的形態特征和生長速率。培養條件：無菌培養室晝溫/夜溫為25 ℃/15 ℃，晝/夜光照時間為14 h/10 h，光照度 2 000 lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基備制 以MS為基本培養基，附加30 g/L蔗糖，7 g/L瓊脂，pH值5.8。在121 ℃高溫高壓滅菌鍋內持續滅菌17 min。

1.2.2 材料處理 添加不同濃度的NO供體硝普鈉和一定濃度的NO專一性猝滅劑cPITO（2-4-carboxyphenyl-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide）處理鐵皮石斛類原球莖。試驗設計見表1，共有4個不同濃度的SNP處理，對應加入一定濃度的cPTIO來驗證是否為外源NO起作用。以正常條件下培養的類原球莖為對照（CK），共6個處理，每個處理3次重復。SNP、cPITO溶液經0.22 μm過濾膜進行過濾滅菌加入到滅菌后的培養基中，事先準備好待用。每個處理20瓶，每瓶接入準確稱量的2.0 g鐵皮石斛類原球莖，在超凈工作臺進行接種。放入光周期12 h/d、光照度2 000 lx、培養溫度（25±1） ℃的培養架上培養。在處理后第30天進行各項指標的測定。

T5為本試驗的驗證試驗處理，試驗最后得出的最適的外源SNP濃度為0.5 mmol/L，對應加入1 mmol/L cPTIO。

1.3 指標測定

1.3.1 生物量測定 取出各處理的鐵皮石斛類原球莖，洗凈培養基，用濾紙吸干水分后稱取其鮮質量，然后在烘箱中于105 ℃殺青20 min，后于60 ℃烘48 h至恒質量，稱取其干質量。

1.3.2 葉綠素測定 參見李合生的丙酮浸提法[13]測定葉綠素含量。取不同處理的鐵皮石斛原球莖鮮樣0.1 g放入 10 mL 離心管中，加入5 mL 80%丙酮溶液，在黑暗條件下浸提48 h直至完全變白，取上清液在645、663 nm下測定吸光度D645 nm、D663 nm。鮮質量含量M單位為μg/g。用以下公式計算出溶液中葉綠素a、b、a+b的含量與鮮質量含量：

1.3.3 多糖的提取及含量測定

1.3.3.1 多糖的提取 采用葉余原的超聲法[14]提取多糖。將測過干質量的原球莖干品研磨過40目篩，稱取干品粉末約0.1 g，用濾紙包好，置于三角瓶中，依次用石油醚（60 ℃）、80%乙醇（80 ℃）在水浴鍋中回流提取去除干擾雜質成分，而后取出樣品置于105 ℃烘箱中干燥（約30 min）。將原球莖粉末洗進試管中，每管加入10 mL超純水，放入KQ-300GVDV型三頻恒溫數控超聲波清洗器中，用超聲波水浴加熱提取。超聲功率恒定為300 W，溫度為80 ℃，持續提取 4 h。

1.3.3.2 多糖含量的測定 多糖的測定采用苯酚硫酸法[15]，以葡萄糖為對照。（1）標準曲線的制備。準確稱取 20 mg 標準葡萄糖于500 mL容量瓶中，加水定容，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL溶液，各以蒸餾水補至2.0 mL，然后加入1.0 mL 5%苯酚、5.0 mL濃硫酸，搖勻冷卻，室溫放置20 min后于490 nm測吸光度；以2.0 mL水按同樣顯色操作為空白對照，橫坐標為多糖質量（μg），縱坐標為吸光度，得標準曲線：

2 結果與分析

2.1 外源NO對鐵皮石斛類原球莖生長的影響

由圖1可知，添加不同濃度的SNP對鐵皮石斛類原球莖生長的影響不同，其干質量變化隨著濃度的增加呈現出先上升后下降的趨勢。T3、T4處理明顯低于對照組；T5處理與對照組接近；T2處理效果最好，與各處理間差異顯著，干質量含量比對照組高36.90%。

2.2 外源NO對鐵皮石斛類原球莖葉綠素含量的影響

如表2所示，隨著SNP濃度的升高，鐵皮石斛類原球莖葉綠素含量呈現出先增加后降低的趨勢。T3、T4處理均低于對照組；T5處理和對照組差異不顯著；T2處理下各項指標明顯高于其他處理，相比對照組葉綠素a含量提高了17.81%，葉綠素b含量提高了12.17%，總葉綠素含量提高了14.91%。

2.3 外源NO對鐵皮石斛類原球莖多糖積累的影響

如圖2所示，與對照組相比，隨著SNP濃度的升高，鐵皮石斛類原球莖多糖含量呈先升后降的趨勢。T3處理效果最佳，且多糖含量顯著高于對照組，高出14.49%；而T4處理抑制了多糖的產生，顯著低于對照，僅為對照的92.21%；T5處理下的多糖含量與對照組差異不顯著。

如圖3所示，與對照組相比，T1、T2處理對鐵皮石斛類原球莖多糖產量表現出促進作用，而T3、T4處理則表現出抑制作用；T5處理多糖產量接近對照組水平；T2處理下多糖產量最高，比對照組高出51.22%，且與各處理間差異顯著。

3 結論與討論

本試驗研究了4種不同濃度的外源NO供體對鐵皮石斛類原球莖的影響。試驗結果表明，隨著加入SNP濃度的增加，鐵皮石斛類原球莖干質量、葉綠素、多糖產量均表現出先上升后下降的規律。說明低濃度的SNP（0.1、0.5 mmol/L）可以促進鐵皮石斛類原球莖生長發育和多糖積累，但是高濃度的SNP（1、2 mmol/L）卻有抑制作用。表現出的這種“低促高抑”效應可能是低濃度的NO可作為信號分子，對植物生長發育和次生代謝產物合成具有促進作用，而高濃度的NO本身對植物細胞有毒害作用。前人研究SNP 對綠豆下胚軸插條生根的試驗表明，生根數與SNP劑量在一定濃度下呈正相關，但是濃度過大時表現出毒害效應[16]；而后劉建新等研究也得到類似的結論[10]。此外，樊洪泓研究外源NO對霍山石斛野生苗和試管苗的生理調節效應發現，SNP在10～50 μmol/L 濃度區間內有利于其生長和代謝，但是當SNP濃度高于75 μmol/LSNP即對霍山石斛試管苗產生明顯的毒害作用[17]。與本試驗得出的結論相似，不過本試驗中T2處理（0.5 mmol/L）SNP效果最好，能顯著地增加鐵皮石斛類原球莖的干質量、葉綠素和多糖含量及產量。這種最佳作用濃度不同可能是因為針對不同的材料對NO的吸收和耐受能力不同。SNP的這種促進作用被NO專一性猝滅劑cPITO所抑制，表明的確是由SNP分解產生的NO所產生的功效，這與徐茂軍等的研究結果[18]相似。

葉綠素是綠色植物中廣泛存在的最主要色素，在光合作用中發揮著重要的生理功能，葉綠素含量的高低直接影響植株的光合強度，從而影響植株的生長[19]。本試驗表明，低濃度SNP提高了葉綠素含量，同時還提高了干質量、多糖產量。樊洪泓等研究也發現，適宜濃度的SNP濃度提高了霍山石解的葉綠素含量、可溶性蛋白含量、苯丙氨酸解氨酶活性，進一步促進了生物堿的合成[17]。Leshem等發現，外源NO處理可促進豌豆葉片的增大，有利于光合作用[20]。邵瑞鑫等研究也發現，經過低濃度SNP處理可以明顯改善小麥葉片的光合性能，從而促進地上部分干物質的積累[21]。因此，可能是因為NO促進了鐵皮石斛類原球莖葉綠素的合成，從而增強了其光合作用，有利于其生長，同時也促成了葡萄糖、果糖、蔗糖等多糖合成的前體物質的增加，進而促進了干物質的積累和多糖的合成。

之前的研究表明，NO參與了植物次生代謝產物的合成調控。本試驗也證明，適宜濃度的外源NO能夠促進鐵皮石斛類原球莖多糖產量的提高。張磊等在研究外源NO對人參愈傷組織次生代謝產物的影響時也發現，NO可以促進多糖和皂苷的積累[22]，與本研究結果一致。金青等試驗表明，外源NO作用雜交石斛類原球莖，刺激類原球莖內源激素水平變化，從而誘導次生生物堿的合成與積累[23]。本試驗中，NO作為信號分子參與了鐵皮石斛類原球莖多糖的代謝，但是由于多糖的代謝途徑尚不明確，因此關于NO對其作用機制還有待進一步研究。

參考文獻：

[1]李 玲，鄧曉蘭，趙興兵，等. 鐵皮石斛化學成分及藥理作用研究進展[J]. 腫瘤藥學，2011，1（2）：90-94.

[2]華允芬. 鐵皮石斛多糖成分研究[D]. 杭州：浙江大學，2005.

[3]李亞芳，張曉華，孫國明. 石斛中總生物堿和多糖的含量測定[J]. 中國藥事，2002，16（7）：426-428.

[4]唐婭梅，張臣良，蘇 兵，等. 鐵皮石斛多倍化誘導與鑒定研究[J]. 北方園藝，2010（17）：147-149.

[5]高正華，楊兵勛，陳立鉆. 鐵皮石斛的研究進展[J]. 中國現代應用藥學，2008，25（增刊2）：692-695.

[6]何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等. 鐵皮石解原球莖多糖DCPP1a-1對氧自由基和脂質過氧化的影[J]. 天然產物研究與開發，2007，19（3）：410-414.

[7]樊洪泓，李廷春，李正鵬，等. 強光脅迫下外源NO對霍山石斛葉綠素熒光和抗氧化系統的影響[J]. 園藝學報，2008，35（8）：1215-1220.

[8]金 青，蔡永萍，林 毅，等. NO對石斛類原球莖內源激素水平及生物堿積累的影響[J]. 核農學報，2010，24（6）：1291-1296.

[9]周永斌，殷 有，蘇寶玲，等. 外源一氧化氮供體對幾種植物種子的萌發和幼苗生長的影響[J]. 植物生理學報，2005，41（3）：316-318.

[10]劉建新，王 鑫，雷蕊霞. 外源一氧化氮供體SNP對黑麥草種子萌發和幼苗生長的影響[J]. 生態學雜志，2007，26（3）：393-398.

[11]Modolo L V，Cunha F Q，Braga M R，et al. Nitric oxide synthase-mediated phytoalexin accumulation in soybean cotyledons in response to the Diaporthe phaseolorum f. sp. meridionalis elicitor[J]. Plant Physiology，2002，130（3）：1288-1297.

[12]徐茂軍. NO調控植物細胞次生產物合成及其信號轉導機制研究[D]. 杭州：浙江大學，2005.

[13]李合生. 現代植物生理學學習實驗指南[M]. 北京：高等教育出版社，2007.

[14]葉余原. 超聲法提取鐵皮石斛多糖工藝的研究[J]. 中藥材，2009，32（4）：617-620.

[15]丁宗博，姜 宏. 保健食品中水溶性多糖的測定[J]. 預防醫學論壇，1999（4）：353.

[16]黃愛霞，余小平. 硝普鈉（SNP）對綠豆下胚軸插條生根的影響[J]. 西北植物學報，2003，23（12）：2196-2199.

[17]樊洪泓. 霍山石斛的分子分類、NO生理調節作用研究及FPS基因的克隆[D]. 合肥：安徽農業大學，2008.

[18]徐茂軍，董菊芳，張 剛. NO對金絲桃懸浮細胞生長及金絲桃素生物合成的促進作用研究[J]. 生物工程學報，2005，21（1）：66-70.

[19]張懷斌. 葉綠素的光學性質及其應用[D]. 濟南：山東師范大學，2008.

[20]Leshem Y Y，Haramaty E. The chatacterization and contrasting effects of the nitric oxide free radical in vegetative stress and senescence of Pisum sativum Linn.foliage[J]. Journal of Plant Physiology，1996，148（3/4）：258-263.

[21]邵瑞鑫，上官周平. 外源NO調控小麥幼苗生長與生理的濃度效應[J]. 生態學報，2008，28（1）：302-309.

[22]張 磊，楊世海. 外源NO對人參愈傷組織次生代謝產物的影響[J]. 人參研究，2010，22（1）：5-9.

[23]金 青，蔡永萍，林 毅，等. NO對石斛類原球莖內源激素水平及生物堿積累的影響[J]. 核農學報，2010，24（6）：1291-1296. 徐昕彤，陳 宇，衛 笑，等. 基于AHP法的南京市節約型園林景觀滿意度評價[J]. 江蘇農業科學，2016，44（4）：260-264.