和田羊KRT35基因遺傳多樣性及其與羊毛長度的關聯性分析

晏華春+馬曉燕+依明?蘇來曼+劉紅嬌+韓煜茹+劉婷婷

摘要：以隨機采集的400只和田羊個體的血樣為材料，利用PCR-SSCP、DNA測序等技術研究分析和田羊KRT35基因的多態性，并與羊毛長度進行關聯分析。和田羊KRT35基因具有多態性，存在3種基因型，即AA、AB和BB，且處于Hardy-Weinberg非平衡狀態，多態信息含量（PIC）為0.366 3，屬于中度多態（0.5>PIC>0.25）。測序結果顯示，與原基因堿基序列相比，KRT35基因編碼區片段在RT35基因組c.122位置發生錯義突變T→C。關聯分析結果表明，和田羊不同基因型之間羊毛長度差異均不顯著。

關鍵詞：和田羊；KRT35基因；多態性；羊毛長度；關聯分析

中圖分類號： S826.2

文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）04-0028-03

和田羊作為和田地毯產業鏈中的重要環節，其羊毛品質的提高將直接促進地毯質量的全面提升，將有力支撐地方經濟的可持續發展。毛纖維具有高度的組織結構，其中毛纖維的90%是由角蛋白中間絲（keratin intermediate filament，KRT-IF）和角蛋白關聯蛋白（keratin-associated proteins，KAPs）構成[1-2]。研究發現，在美利奴羊中，KAP1.1、KAP1.3、K33等KAPs影響羊毛性狀和品質[3]，KAP1-4也影響羊毛性狀[4]，KRT27、KRT85、KRT35、KRT31、KRT38、KAP6.1和KAP4.3等影響毛囊分裂和毛囊結構[5]。遺傳因素涉及綿羊品種及其他重要功能基因，是影響綿羊經濟性狀的基本因素[6-7]。所以很多學者普遍通過基因方面的研究，認為多基因對毛絨性狀影響較大，可能存在主效基因，因此當前的研究熱點主要是毛絨纖維的角蛋白中間絲和角蛋白關聯蛋白相關基因的研究。KRT35基因是角蛋白中間絲蛋白家族之一，本試驗選擇優良的異質半粗毛短脂尾和田羊作研究對象，采用PCR、DNA測序等技術對和田羊KRT35基因進行多態性檢測，并和其對應的羊毛長度進行關聯性分析，主要為找到改善其羊毛長度分子標記位點，為新疆和田羊經濟性狀的選育、品種資源的保存提供一定的遺傳學理論依據，從而達到對當地農牧民生活質量的提高。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣本的采集 本試驗選擇年齡、個體差異小，健康無病的新疆和田羊400只，作為試驗材料。采集血樣是和田羊頸部靜脈5 mL，用枸櫞酸鈉抗凝，置于-20 ℃長期凍存。

1.1.2 主要藥品和試劑 Taq DNA聚合酶、上下游引物、dNTPs、Marker、Tris平衡酚、6×Loading buffer、10×PCR buffer、EDTA、NaCl、Tris·HCl、SDS、無水乙醇、溴化乙錠、硼酸、二甲苯氰、過硫酸銨、溴酚藍、瓊脂糖、變性劑、聚丙烯酰胺、染色液、超純水。

1.1.3 主要試驗儀器 移液器，ZHJH C1112B型超凈工作臺，BIOFUGE PRIMOR型低溫離心機，IKA MS3型圓周振蕩器，JY04S型凝膠成像儀，Mini-6K型微型離心機，PCR儀，DYCP-31CN型瓊脂糖水平電泳槽，PowerPac Basic型電泳儀，電冰箱，電子天平，微波爐。

1.2 試驗方法

采用常規的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE中，-20 ℃保存備用。用1%～1.5%的瓊脂糖來檢測提取的基因組DNA的效果。根據KRT35基因在GenBank中的序列，用Primer Premier 5. 0 軟件獨立設計完成引物，由上海生物工程技術有限責任公司合成。F：GGCTCGAAGCTCCATCAC；R：CCGTAGCTGGTAGCAAAGC。

1.2.1 PCR反應條件體系和反應程序 PCR反應條件體系：PCR Green Mixture 10 μL，上游引物（10 pmol/μL）0.6 μL，下游引物（10 pmol/μL）0.6 μL，模板DNA（50 ng/μL）1.5 μL，超純水7.3 μL，總體積20 μL。

PCR反應的程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，退火溫度40 s，72 ℃延伸60s，35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR產物的SSCP分析方法參考周延清等的方法[8]進行。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳：取10 μL PCR產物和7 μL變性劑98 ℃變性10 min，然后冰浴30 min，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。電泳300 V 50 mA空跑30 min，預跑10 min，180 V電泳15 h后銀染顯色。用凝膠成像系統拍照、分析、判定各種基因型。

1.2.2 測序 選擇基因型不同的樣品，PCR擴增后對PCR原液直接測序。

1.3 數據處理

本試驗數據經 Microsoft Excel軟件初步處理，并用SPSS 17.0軟件系統進行One-way ANOVA 對不同處理間的處理效應進行方差分析。測定結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 提取DNA結果檢測

本試驗采用酚-氯仿抽提法從和田羊血樣品中提取基因組DNA。圖1是提取DNA在1%的瓊脂糖凝膠中的檢測結果，基因組DNA各泳道都有1條清晰的條帶，無拖尾現象。

2.2 PCR 擴增結果

按照PCR擴增體系，以和田羊血液中提取的DNA作為模板，在PCR儀中擴增得到PCR產物，然后經1%的瓊脂糖凝膠檢測。結果表明擴增片段特異性良好，長度約為279 bp，無引物帶和其他雜帶，可以用于PCR-SSCP分析（圖2）。

2.3 PCR-SSCP檢測結果