阿扎霉素F產生菌鏈霉菌211726基因轉移系統的建立

馬艷玲劉富來張敏孫宇輝洪葵

（1. 佛山科學技術學院食品與園藝學院，佛山 528231；2. 武漢大學藥學院，武漢 430071）

阿扎霉素F產生菌鏈霉菌211726基因轉移系統的建立

馬艷玲1劉富來1張敏1孫宇輝2洪葵2

（1. 佛山科學技術學院食品與園藝學院，佛山 528231；2. 武漢大學藥學院，武漢 430071）

旨在建立阿扎霉素F產生菌鏈霉菌211726的基因轉移系統，以便基因敲除和外源基因表達等遺傳操作。以整合型質粒pSET152和pIB139為出發質粒，通過接合轉移構建了阿扎霉素F產生菌鏈霉菌211726的基因轉移系統。結果顯示25 μg/mL阿泊拉霉素可有效篩選接合子。經PCR驗證，質粒成功整合到菌株鏈霉菌211726基因組中，接合子經多次傳代后，導入的質粒 pSET152和pIB139仍穩定整合于接合子基因組上。

阿扎霉素F；鏈霉菌211726；接合轉移；遺傳穩定性

鏈霉菌（Streptomyces）在分類學上屬于原核生物界、放線菌目、鏈霉菌科，是一類具有分枝絲狀體的好氧革蘭氏陽性細菌［1］，是土壤中主要的微生物類群之一。鏈霉菌基因組平均大小為8 000 kb，約為大腸桿菌基因組的兩倍［2］。同其它生物相比，其基因組最大特征之一就是其DNA具有極高的G+C mol%，可高達69%-78%，是迄今為止已知的G+C mol%含量最高的生物類群之一［3］。鏈霉菌是工業微生物中最具有商用價值的類群之一。人們已經了解到自然界中有近70%的抗生素是由鏈霉菌及其近緣放線菌產生的。自1928年Alexander Fleming發現第一個抗生素——青霉素以來，數以萬計的抗生素正源源不斷地被人們發現和創造出來并造福于人類［4-7］。

阿扎霉素F最早是由Arai［8］于1959年發現并從吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus var.中分離得到的。1995年，Krystofova［9］研究組對該抗生素的鈣離子通道作用進行了初步的研究。

2010年，研究人員在海南省的沿海紅樹林根系土壤中分離純化得到Streptomyces sp. 211726。經過發酵培養和產物結構鑒定，發現它可以同時產生13種結構略有差異的系列阿扎霉素，區別僅僅在于阿扎霉素C-23位和C-25上連接的基團不同［10-13］，并對所發現的這13種化合物命名為阿扎霉素S4-S16，其中S13、S15和S16分別與國際上已報道的阿扎霉素F3a、F4a和F5a結構一致［14］。生物學活性檢測表明，在這一系列化合物中以阿扎霉素F3a為代表的多種化合物都具有明顯的抗尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）活性［10-13］，表明該類抗生素在抗香蕉枯萎病病原菌具有良好防治作用。這些化合物還對白色念珠菌表現出明顯的拮抗作用，其抗白色念珠菌（Candida albicans）的有效性與氟康唑（Fluconazole）和兩性霉素B相當，就其毒性而言，阿扎霉素F系列化合物的毒性較氟康唑大，但是小于兩性霉素B［15］。此外，毒性實驗還表明在Streptomyces sp. 211726所產生的阿扎霉素F系列化合物中除阿扎霉素F5a外其余12種化合物均對人類結腸癌細胞HCT-116表現出一定的細胞毒作用，預示著該系列化合物在人類腫瘤疾病治療方面的潛在應用［13］。由于致病真菌耐藥性的日益嚴重和結構修飾研究的日益深入，因此開展以提高有效性、降低毒性為目的的結構改造研究越來越得到人們的廣泛關注。但是目前關于阿扎霉素F的分子水平上的結構改造研究還尚未報道，這可能與其限制性修飾作用強，遺傳操作困難有關。因此，有必要建立起阿扎霉素F產生菌鏈霉菌21172的接合轉移體系，以推動其分子生物學研究。

本研究擬建立阿扎霉素F產生菌鏈霉菌211726的基因轉移體系，探討通過接合轉移向鏈霉菌211726導入外源DNA片段的可能性，旨在為該菌的生物合成基因改造奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 阿扎霉素F產生菌鏈霉菌211726是洪葵教授贈與，基因克隆受體E.coli DH10B、接合轉移供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）、整合型質粒pSET152和pIB139（均攜帶阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV，接合轉移位點oriT）均為筆者實驗室保存。

1.1.2 試劑 硫鏈絲菌素和阿泊拉霉素購自美國Sigma公司；氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、硫鏈絲菌素、Lambda/Hind III、限制性內切酶、DNA 回收試劑盒、質粒提取試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；其他常用試劑均購于上海國藥集團。

1.1.3 培養基和抗生素 鏈霉菌211726的平板培養基為 SFMS，培養細菌的為LB培養基、孢子預萌發培養基為2×YT、接合轉移使用的是SFMS培養基。

LB中抗生素終濃度為：阿泊拉霉素25 μg/mL，氯霉素25 μg/mL，卡那霉素25 μg/mL，氨芐青霉素100 μg/mL；接合轉移培養基中抗生素終濃度為阿泊拉霉素25 μg/mL，萘啶酮酸25 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 抗生素敏感性實驗 將已滅菌的SFMS培養基融化，溫度降至45℃，加入適當質量濃度的抗生素（卡那霉素 0-100 μg/mL；氯霉素 0-100 μg/mL；阿泊拉霉素 0-100 μg/mL；硫鏈絲菌素 0-100 μg/ mL），將鏈霉菌211726菌株的孢子懸液涂布平板，28℃培養5 d，根據鏈霉菌211726菌株生長狀態評定鏈霉菌211726菌株對抗生素的敏感性。

1.2.2 質粒DNA的跨屬接合轉移 將整合型質粒pSET152和pIB139通過CaCl2法導入接合轉移供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）中，借助于pUZ8002上tra基因，上述兩種質粒以接合轉移方式從大腸桿菌導入到鏈霉菌211726細胞中，并進行整合。接合轉移方法主要依據文獻［16］進行改進。

1.2.3 接合轉移子的驗證 以整合型質粒pSET152和pIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV為模板，設計引物CP1和CP2以驗證陽性接合轉移子。CP1：5'-TTTATCACCACCGACTATTTGC-3'；CP2：5'-TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。按照文獻［9］方法提取鏈霉菌211726基因組DNA并進行PCR驗證。PCR條件反應程序為：98℃ 1 min；98℃ 30 s，58℃30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃ 延伸10 min。

1.2.4 質粒pSET152和pIB139在鏈霉菌211726接合轉移子中的穩定性 將接合子接種于不含抗生素的SFMS平板上，待其孢子成熟（約15 d）后，再次接種于不含抗生素的SFMS平板上，連續轉接3次后進行分離純化，隨機挑選單菌落，轉接到含有25 μg/mL阿泊拉霉素的SFMS平板上，5 d后根據單菌落能否生長來確定質粒pSET152和pIB139在接合子中的遺傳穩定性。

2 結果

2.1 鏈霉菌211726對不同抗生素抗性水平的檢測

為確定抗生素抗性基因能否用于鏈霉菌211726菌株進行遺傳操作的選擇標記，檢測了鏈霉菌211 726菌株對幾種抗生素（阿泊拉霉素、氯霉素、卡那霉素、硫鏈絲菌素等）的抗性水平。結果（表1）顯示，鏈霉菌211726菌株在含有12.5 μg /mL卡那霉素和阿泊拉霉素的培養基上不能生長，表明鏈霉菌211726菌株對卡那霉素和阿泊拉霉素非常敏感；鏈霉菌211726菌株在含有25 μg /mL氯霉素的培養基上不能生長，表明鏈霉菌211726菌株對氯霉素比較敏感；鏈霉菌211726菌株在含有硫鏈絲菌素100 μg/mL的培養基上都能生長，說明鏈霉菌211726對硫鏈絲菌素不敏感。鑒于本研究中使用的接合轉移質粒攜帶有阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV，因此以25 μg /mL阿泊拉霉素篩選接合轉移子。

表1 鏈霉菌211726在4種不同濃度抗生素平板上的生長情況

2.2 鏈霉菌211726與大腸桿菌之間兩親接合轉移

通過兩親接合轉移法分別將質粒pSET152和pIB139從供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）導入到鏈霉菌211726的新鮮菌絲體和孢子中，結果表明，在鏈霉菌211726菌株萌發孢子作為受體菌與含有質粒pSET152和pIB139的大腸桿菌E.coli ET12567（pUZ8002）菌株進行兩親接合轉移的實驗中，能夠獲得阿泊拉霉素的抗性菌落；而在鏈霉菌211726菌株新鮮菌絲體作為受體菌與含有質粒pSET152和pIB139的大腸桿菌E.coli ET12567（pUZ8002）菌株進行的兩親接合轉移的實驗中，沒有得到阿泊拉霉素的抗性菌落。

2.3 供體菌和受體菌的比例

為了確定接合轉移過程中受體菌和供體菌接種最佳比例，不同比例的大腸桿菌和鏈霉菌211726孢子進行混合涂布平板。結果（表2）表明，當大腸桿菌與孢子的比例達到8∶1時，獲得的接合轉移子數最多。

表2 基于鏈霉菌孢子的接合轉移平板統計

2.4 接合轉移子的驗證

以CP1和CP2為引物進行PCR擴增驗證，并以出發菌株鏈霉菌211726基因組DNA的擴增結果作為陰性對照，質粒pSET152和pIB139的擴增結果作為陽性對照，擴增結果（圖1）顯示，所獲得的2株接合轉移子都可以擴增出預測的882 bp條帶。分別回收2 株接合轉移子擴增條帶，TA克隆后送測序，測序結果也證實了2株皆為陽性克隆子。

圖1 來自pIB139和pSET152接合轉移子的PCR驗證

2.5 質粒pIB139和pSET152在鏈霉菌211726接合轉移子中的穩定性

為了檢測質粒pIB139和pSET152在鏈霉菌211726菌株中的穩定性，隨機挑取驗證正確的 200個接合轉移子，發現它們在添加有阿泊拉霉素和無抗生素的SFMS培養基平板上都能生長，沒有發現阿泊拉霉素抗性消失的菌落。結果表明質粒pIB139和pSET152在鏈霉菌211726菌株中可穩定存在。

3 討論

將外源DNA導入宿主細胞的方式主要有：鈣轉化、接合轉移、電轉化和顯微注射等。其中，接合轉移因導入效率較高、高度跨種屬差異、價格低廉、操作方便等優勢被廣泛應用于鏈霉菌研究領域。

質粒是一種閉合環狀雙鏈DNA［17］，它不屬于基因組DNA，游離于染色體DNA之外。在鏈霉菌遺傳操作中人們常將其作為載體來介導外源DNA向宿主細胞的導入。載體可依據其是否能整合到鏈霉菌染色體DNA上的特點分為整合型載體和非整合型載體，例如，整合型質粒pIB139和pSET152［18，19］。而非整合型載體又可依據其是否含有鏈霉菌復制子分為自殺型載體和游離型載體［20］，例如游離型載體pYH7［21，22］。

在接合轉移過程中，含有外源載體的供體菌（大腸桿菌）和受體菌鏈霉菌在同一個平板上生長時，兩者之間存在不可避免的相互競爭。由于鏈霉菌的生長速度比大腸桿菌的生長速度緩慢，過量的大腸桿菌會使鏈霉菌的生長受到抑制，導致接合轉移率降低。因此，在建立一個新菌株的遺傳操作系統時摸索供體菌與受體菌之間的最佳比例就尤為重要。

4 結論

本研究通過對鏈霉菌211726抗生素敏感性測定和基于孢子和菌絲體接合轉移系統的摸索，成功地將位點特異性整合型載體質粒pIB139和pSET152整合到鏈霉菌211726染色體中，在分子水平證明所獲得的接合轉移子的正確性，這說明本研究建立的遺傳操作系統是有效可行的。

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（責任編輯 李楠）

The Construction of the Gene Transfer System of Strain Streptomyces sp. 211726 Producing Azalomycin F

MA Yan-ling1LIU Fu-lai1ZHANG Min1SUN Yu-hui2HONG Kui2
（1. College of Food and Horticultural Sciences，Foshan University，Foshan 528231；2. School of Pharmaceutical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430071）

The objective of this study is to establish the gene transfer system of strain Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F，which can be used for genetic manipulations such as gene knock-out and expression of foreign genes. Intergeneric genetic transfer system of Streptomyces sp. 211726 producing azalomycin F was constructed by conjugating integrative plasmid pSET152 with pIB139. Results showed that 25 mg/mL apramycin may be used to efficiently screen conjugants. PCR verification revealed that exogenous plasmid was successfully integrated in the chromosomal DNA of Streptomyces sp. 211726. The continuous passage culture experiment demonstrated that transformed pSET152 and pIB139 of conjugants were stably inherited.

azalomycin F；Streptomyces sp. 211726；conjugation；genetic stability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.026

2015-07-23

國家自然科學基金項目（31270120），佛山市科技計劃項目（2014GA000425，2014AG10007）

馬艷玲，女，博士，研究方向：食品生物技術；E-mail：mayanling100@163.com