豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因的原核表達

楊秀芬，榮 俊，李國攀

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所，湖北荊州434025)

黃巧珍

(浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000)

?

豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因的原核表達

楊秀芬，榮 俊，李國攀

(長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；長江大學(xué)生物醫(yī)藥研究所，湖北荊州434025)

黃巧珍

(浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000)

[摘要]根據(jù)豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)M基因序列設(shè)計2對引物，通過PCR擴增得到了PRRSV M基因的全長片段和N-末端截短67個氨基酸序列的MNd67基因片段，分別將這些片段插入到表達質(zhì)粒pET-28a(+)的多克隆位點上構(gòu)建重組表達質(zhì)粒，PCR、酶切及測序鑒定表明，成功構(gòu)建了2種重組表達質(zhì)粒(pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)后利用α-乳糖誘導(dǎo)其表達，SDS-PAGE電泳分析表明，E.coli BL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67成功表達分子質(zhì)量為14ku的重組蛋白，而E.coli BL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未見明顯的表達蛋白。試驗結(jié)果表明已成功表達截短的PRRSV M蛋白，可為PRRSV診斷抗原和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]豬生殖與呼吸綜合征病毒；M蛋白；原核表達

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS virus，PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病，臨床表現(xiàn)主要以妊娠母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙和仔豬呼吸困難為特征[1]。我國于1996年發(fā)現(xiàn)該病[2]，其后廣泛地流行于全國各地[3]，并成為我國養(yǎng)豬生產(chǎn)中主要疫病之一。2006年以來，我國出現(xiàn)和流行以Nsp2編碼區(qū)缺失30個氨基酸為分子特征的高致病性PRRSV，感染豬群出現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[4,5]。

PRRSV是動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬、單股正鏈RNA病毒。其基因組全長約15kb，含有9個開放閱讀框(ORFs)，ORF1a和ORF1b編碼蛋白聚合酶，ORF2～7 分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白[6]。其中M蛋白分子量為18～19ku，為III型跨膜蛋白，且是非糖基化蛋白，由1個3次連續(xù)的疏水性跨膜區(qū)、13～18個氨基酸的胞外區(qū)和81～87個氨基酸的胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成[7]。在PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中，M蛋白的氨基酸序列在歐洲型和美洲型毒株之間最為保守，氨基酸同源性為78%～81%[8]。豬在感染PRRSV約10d后，可檢測到針對 M 蛋白的特異性抗體。感染細胞中的 M 蛋白與 GP5 在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成異源二聚體，這種結(jié)構(gòu)在病毒的組裝和釋放中起重要作用[9]。此外，M 蛋白內(nèi)部可以形成以二硫鍵結(jié)合的同型二聚體，這可能與病毒的感染力有關(guān)[10]。M 蛋白免疫原性較強，可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，且是引起細胞免疫應(yīng)答最強的蛋白[11]。因此，M蛋白在PRRSV血清學(xué)診斷和疫苗開發(fā)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。本研究通過設(shè)計特異性PCR引物對M蛋白進行全基因和截短表達的研究，使截短的M蛋白在大腸桿菌中獲得表達，以為PRRSV診斷和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1cDNA、質(zhì)粒和試劑

PRRSV cDNA、原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)由長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物科學(xué)實驗室保存，pMD-18T 載體購自大連寶生物工程有限公司，E.coliDH5α、BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細胞購自全式金生物技術(shù)有限公司，ExTaq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自大連寶生物工程有限公司，Trans2K Plus DNA Marker 、ProteinRuler I購自全式金生物技術(shù)有限公司，小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司，抗PRRSV陽性血清由浙江諾倍威生物技術(shù)有限公司質(zhì)量管理部提供，HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體購自KPL公司，其他試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank收錄的PRRSV(AF046869)株M基因序列設(shè)計引物。引物序列見表1。其中5’-端下劃線部分是附加的酶切位點，上游引物為EcoRⅠ，下游引物為XhoⅠ。所有引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

表1　PRRSV M基因引物列表

1.2.2目的基因的PCR擴增

以PRRSV cDNA為模板，使用上述引物PCR擴增M全序列和MNd67片段。反應(yīng)條件均為：94℃5min；94℃45s，64℃45s，72℃45s，35個循環(huán)；72℃10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，并切膠回收并純化目的片段。

1.2.3重組表達載體的構(gòu)建

純化后的目的片段連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細胞，涂布于加有Amp的LB平板上培養(yǎng)。挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定，選取陽性轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒連同表達質(zhì)粒pET-28a(+)分別用EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切，回收目的片段與載體片段，在T4DNA連接酶作用下16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α化學(xué)感受態(tài)細胞，涂布于加有Kan的平板上培養(yǎng)。挑取單個菌落進行菌落PCR鑒定，選取陽性轉(zhuǎn)化菌提取質(zhì)粒并做雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海生工公司測序，構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒分別命名為pET28a-PRRSV M及pET28a-PRRSV MNd67。

1.2.4目的基因的表達

將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細胞中，其轉(zhuǎn)化菌分別命名為E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M和E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67。挑取單個菌落接種于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～12h，進行菌落PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌株按1%轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，當(dāng)D600nm值為0.8～1.0時，加入0.6mol/L α-乳糖至終濃度為30mmol/L，誘導(dǎo)5～6h, 離心收集菌體。

1.2.5表達蛋白的SDS-PAGE鑒定與Western blot分析

用0.02mol/L pH7.4 PBS重懸菌體并用超聲波破碎，分別收集破碎后的全菌液、上清液及沉淀。取破碎后的全菌液和上清液分別進行SDS-PAGE電泳，檢測重組蛋白的表達情況。對表達蛋白進行Western blot分析，以1∶100稀釋的抗PRRSV陽性血清為一抗，1∶8000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體為二抗，用DAB溶液顯色并觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1目的基因片段的擴增

M：Trans2K Plus DNA Marker；1～2：PRRSVMNd67；3～4：PRRSV M全基因圖1　目的基因的擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)在525bp和324bp處有特異性DNA擴增條帶(圖1)，與理論擴增產(chǎn)物長度相符。

2.2重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67分別經(jīng)EcoRⅠ+XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，分別顯示2條帶且與載體和目的片段的大小相符(圖2)。DNA測序結(jié)果與實驗設(shè)計的序列一致，顯示基因序列無堿基的插入與缺失，表明已正確構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-PRRSV M和pET28a-PRRSV MNd67。

2.3SDS-PAGE與Western blot分析結(jié)果

含有各重組表達載體的陽性菌經(jīng)α-乳糖誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSV M未見明顯的蛋白表達帶，E.coliBL21(DE3)/ pET28a-PRRSV MNd67在分子量大小為14ku處可見明顯表達帶，與預(yù)期大小相符，表達蛋白少量可溶(圖3)。表達產(chǎn)物Western blot檢測，未出現(xiàn)明顯雜交條帶。

M:Trans2KPlusDNAMarker;1:pET28a-PRRSVMNd67雙酶切質(zhì)粒;2:pET28a-PRRSVMNd67原始質(zhì)粒;3:pET28a-PRRSVM雙酶切質(zhì)粒;4:pET28a-PRRSVM原始質(zhì)粒圖2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果1:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVM全菌液;2:pET28a空白菌表達上清液;3:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67全菌液;4:E.coliBL21(DE3)/pET28a-PRRSVMNd67上清液;M:ProteinRulerI圖3 PRRSVM蛋白表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳分析

3討論

膜蛋白的表達一直是大腸桿菌表達系統(tǒng)應(yīng)用的難點，許多膜蛋白由于疏水性氨基酸含量較高，表達出來的蛋白錨定在細胞膜上，從而對膜造成破壞導(dǎo)致細胞裂解，影響表達量。M蛋白為III型跨膜蛋白，是PRRSV囊膜基質(zhì)蛋白，其N端含有3個疏水性比較高的跨膜區(qū)域，給其原核表達帶來不便。從國內(nèi)外的報道來看，已有多種表達系統(tǒng)用于表達重組M蛋白，均未獲得理想結(jié)果。有報道稱對ORF6基因進行改造，去除N端疏水區(qū)域后理論上對表達產(chǎn)物的抗原性不會產(chǎn)生太大影響，并且有利于M蛋白的表達量的提高。已有的研究成果以及在線跨膜區(qū)預(yù)測軟件和抗原表位預(yù)測軟件顯示M蛋白N端的3個疏水性跨膜區(qū)位于氨基酸序列前100位，幾乎所有抗原表位都位于氨基酸序列后100位[12]。戚亭等[13]去除了M蛋白N端疏水性較強的區(qū)域，表達了長約290bp PRRSV M融合蛋白，該蛋白仍然能夠與抗PRRSV豬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。鄧靜等[14]去除全部的編碼疏水性跨膜區(qū)的核苷酸序列，對M蛋白從第104個氨基酸序列到C-端第4個氨基酸序列擴增，截短后的M基因獲得了表達，且表達的M蛋白部分可溶、部分為包涵體，Western blot檢測有明顯雜交帶。

本研究同時表達PRRSVM全蛋白和N-端截短67個氨基酸的PRRSV M蛋白。結(jié)果表明，全長的M蛋白誘導(dǎo)后未見明顯表達，N端截短67個氨基酸的M蛋白誘導(dǎo)后表達了分子質(zhì)量約為14ku的重組蛋白，且SDS-PAGE檢測顯示該重組M蛋白部分可溶，這與鄧靜等的[14]研究結(jié)果相符。但是截短表達的M蛋白Western blot檢測未見明顯雜交帶，可能解釋的原因一是Western blot使用的一抗血清為PRRSV 多克隆抗血清，未經(jīng)純化，效價較低；二是M蛋白主要引起機體的細胞免疫，而誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的中和抗體的量有限，Western blot不易檢出，這些都有待后續(xù)進一步研究。綜上所述，本研究成功表達了截短的PRRSV M 蛋白，為PRRSV診斷抗原和疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻]

[1]Rossow K D.Porcine reproductive and respiratory syndrome [J].Veterinary Pathology Online， 1998，35：1～20.

[2]郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似 PRRS 流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病，1996，(2)：1～5.

[3]Gao Z Q，Guo X，Yang H C.Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus[J].Archives of virology，2004，149：1341～1351.

[4]Zhou L，Yang H.Porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].Virus research， 2010，154：31～37.

[5]An T Q，Tian Z J，Xiao Y，etal. Origin of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，China[J].Emerging Infectious Diseases，2010，16：365～367.

[6]Madsen K G，Hansen C M，Madsen E S，etal.Sequence analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus of the American type collected from Danish swine herds [J].Archives of virology，1998，143：1683～1700.

[7]Meulenberg J J，Petersen-Den Besten A，De Kluyver E P，etal. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus[J].Virology，1995，206：155～163.

[8]Dea S，Gagnon C A，Mardassi H，etal.Antigenic variability among North American and European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as defined by monoclonal antibodies to the matrix protein[J].Journal of clinical microbiology，1996，34：1488～1493.

[9]Mardassi H，Massie B，Dea S.Intracellular synthesis，processing，and transport of proteins encoded by ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virology，1996， 21：98～112.

[10]Faaberg K S， Even C，Palmer G A，etal.Disulfide bonds between two envelope proteins of lactate dehydrogenase-elevating virus are essential for viral infectivity[J].Journal of virology，1995，69：613～617.

[11]Bautista E M，Suarez P，Molitor T W.T cell responses to the structural polypeptides of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Archives of virology，1999，144：117～134.

[12]袁明銘.豬繁殖與呼吸綜合征M基因的原核表達與間接ELISA方法的建立[D].成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[13]戚亭，崔尚金，張超范.截短的豬生殖與呼吸綜合征病毒 M 基因的原核表達[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2008，38(6)：457～460.

[14]鄧靜，袁明銘，文心田，等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒 M 基因的截短表達及間接 ELISA 檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2014(7)：734～741.

[收稿日期]2016-03-03

[作者簡介]楊秀芬(1988-)，女，碩士生，研究方向為基因工程疫苗。通信作者：榮俊，496281344@qq.com。

[中圖分類號]Q786

[文獻標(biāo)識碼]A

[文章編號]1673-1409(2016)09-0046-04

[引著格式]楊秀芬，榮俊，李國攀,等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒M基因的原核表達[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版) ，2016，13(9)：46～49.