糞菌移植對營養性肥胖大鼠血脂及腸道屏障的影響

郭上齊　武華　翟春寶　程鞏　蔡景融.山西醫科大學，山西太原　0000；2.山西醫科大學第一醫院普外科，山西太原　0000；.山西省人民醫院普外科，山西太原　0000

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糞菌移植對營養性肥胖大鼠血脂及腸道屏障的影響

郭上齊1△武華2▲翟春寶3程鞏1蔡景融1
1.山西醫科大學，山西太原030001；2.山西醫科大學第一醫院普外科，山西太原030001；3.山西省人民醫院普外科，山西太原030001

[摘要]目的觀察糞菌移植對營養性肥胖大鼠血脂及腸道屏障的影響。方法將40只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組NG，肥胖組HGA、HGB。正常對照組NG喂以普通飼料；肥胖組HGA、HGB喂以高脂、高能飼料，分別飼養6周建立肥胖模型。造模后，HGA組肥胖大鼠通過灌腸移植NG組大鼠的糞菌，HGB組肥胖大鼠、NG組用生理鹽水灌腸,每周1次，連續3周。觀察實驗第6周末和9周末大鼠體重、Lee指數變化。第9周末測大鼠血內毒素、α-腫瘤壞死因子（TNF－α）、血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）及肝指數。取肝臟行病理學檢查。結果高脂飲食喂養6周的大鼠體重明顯增加（P＜0．05）。第9周末，HGA組Lee指數、肝指數、血清TG、TC、TNF－α及血漿內毒素均明顯低于HGB組（P＜0．05）。結論糞菌移植能對肥胖大鼠起到減輕內毒素血癥、調節血脂，減輕肝脂肪變性的作用。

[關鍵詞]肥胖；糞菌移植；腸道屏障；腸道菌群

△在讀碩士研究生▲通訊作者

肥胖在世界各國普遍存在，而且其發病率有逐漸升高的趨勢。但到目前為止還沒有一種特效的治療方法。大量的研究表明，肥胖的發生與腸道菌群以及腸道屏障有密切的關系。近年來，糞菌移植(FMT)研究進展迅速并且倍受矚目。糞菌移植也開始用于多種疾病的治療，包括治療胃腸道疾病、代謝疾病、自身免疫性疾病、神經系統疾病等[1]。本研究，我們應用血漿內毒素水平間接了解腸黏膜屏障損傷程度，用血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、Lee指數、肝指數（%）評估對營養性肥胖大鼠的影響，對FMT能否改善肥胖進行綜合評價，為其臨床應用提供依據，現報道如下。

1　資料與方法

1.1動物模型制備和糞菌液制備

取健康雄性SD大鼠40只（清潔級，初斷乳，體重70～98 g，飼養于清潔級動物實驗室，保持室溫20～24℃，相對濕度50%～60%，人工光照時間12時/d），每日上午更換食、水1次，單籠飼養觀察1周，能正常飲食者納入實驗用鼠。隨機取10只作為正常對照組，喂以普通飼料；余30只用于模型建立，喂以高脂、高能飼料。供給飼料的量為第1、2周內每天每只鼠13 g，以后每周增加2 g，至第6周止。每天的飼料吃完后不再添加。飲水不限。喂養6周后選擇體重大于對照組均數20%[3]的18只大鼠作為肥胖大鼠進行實驗。高脂飼料（g/100 g）[2]：奶粉10、豬油10、全蛋13、白糖7、普通飼料60、以及濃縮魚肝油10滴。飼料均為山西醫科大學動物中心配制。

新鮮糞菌液制備流程[4，5]：①用滅菌燒杯稱取10 g正常大鼠新鮮糞便，加入37℃無菌0．9%NaCl溶液50 mL攪拌，進行初步均質加工；②用雙層無菌紗布過濾，以去除未吸收的食物殘渣和小顆粒物質，進一步勻質處理；③將再次過濾的樣本以6000轉/min的速率離心15 min，并將沉淀再懸浮于50 mL 0.9%NaCl溶液中，得無色無味糞菌液。

1.2動物分組

造模后，分別于第7、8、9周HGA組肥胖大鼠通過灌腸移植正常大鼠糞菌液，HGB組肥胖大鼠、NG組正常大鼠用生理鹽水灌腸。用手壓迫肛門并將大鼠頭向下傾斜45°放置1 min以防止回流。每周1次，連續3周。三組飲食不變。

1.3標本采集與制備

1.3.1標本采集第9周末，所有大鼠禁食過夜。麻醉后開腹，使用無熱原采血針穿刺門靜脈取全血2 mL，低溫離心后，吸取上清液，于-20℃保存；門靜脈取血后，行腹主動脈穿刺取全血4～5 mL，低溫離心后，吸取上清液，于-20℃保存。

1.3.2血脂測定應用全自動生化分析儀，測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG），操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.3.3血漿內毒素采用鱟試劑偶氮終點顯色法測定血漿內毒素濃度，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.4血漿TNF-α采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血漿TNF-α濃度，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.6病理組織學檢查取大鼠右葉肝組織，10%甲醛液固定，病理切片HE染色，判斷大鼠肝臟脂肪變性程度，分（－）～（＋＋＋＋）4個等級[6]。

1.4統計學處理

采用SPSS13.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較用行F檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1大鼠一般情況、體質量及肝指數變化

實驗期各組大鼠飲食及糞便均正常，未發現呼吸道、消化道疾病及其他疾病。造模期間，與正常對照組大鼠比較，高脂組部分大鼠活動減少。造模后，高脂組大鼠體質量及Lee指數高于NG組，差異具有統計學意義（P＜0.05）。第9周末HGA組與HGB組比較，體質量及lee指數下降（P＜0.05）。見表1。

表1　各組SD大鼠體質量、Lee指數及肝指數比較（±s）

表1　各組SD大鼠體質量、Lee指數及肝指數比較（±s）

注：與HGB比較，t=-1.778，aP=0.755；t=-24.222，cP=0.005；t=-0.111，eP=0.967；t=-12.833，gP=0.000；t=-0.420，iP=0.000；與NG比較，t=94.311，bP=0.000；t=92.722，dP=0.000；t=6.329，fP=0.024；t=11.774，hP=0.000；t= 0.426，jP=0.000

228.5±16.6 321.2±19.5cd345.4±13.2 132.58 ＜0.01 289.7±5.3 296.0±4.6ef296.1±7.1 4.00 0.03 292.2±5.8 303.9±6.0gh316.8±2.2 57.20 ＜0.01 2.85±0.11 3.27±0.14ij3.69±0.29 45.67 ＜0.01肝指數（%）組別n 體重（g）6周　9周Lee指數6周　9周170.8±17.3 265.1±6.5ab266.9±8.0 204.77 ＜0.00 NG HGA HGB F值P 10 99

2.2對大鼠血脂影響

第9周末，高脂組大鼠TG、TC明顯高于NG組，差異有統計學意義（P＜0.05）。與HGB組比較，HGA組TG、TC下降（P＜0.05）。見表2。

2.3血漿TNF-α變化

第9周末，高脂組大鼠血漿TNF-α水平均高于NG組（P＜0.05）。HGA組血漿TNF-α水平低于HGB組（P＜0．05）。見表2。

2.4大鼠血漿內毒素變化

第9周末，高脂組大鼠血漿內毒素均高于NG組（P＜0.05）。HGA組血漿內毒素水平低于HGB組（P＜0.05）。見表2。

2.5形態學觀察結果

大鼠肝臟標本HE染色，光鏡下觀察，NG組正常肝小葉結構，未見肝細胞脂肪變、壞死及炎性細胞浸潤。HGA和HGB組均出現程度不同的肝細胞脂肪變性，HGA主要為-～+，未見肝細胞壞死、纖維化及炎癥細胞浸潤；HGB組主要為+～++，未見肝細胞壞死、炎性細胞浸潤及纖維化（封三圖2）。

3　討論

肥胖的形成與人體腸道菌群、免疫反應以及弱炎癥反應存在密切關系[7]。

腸道菌群是宿主細胞數量的10倍，又是腸道屏障的重要組成部分，其代謝水平相當于人體肝臟的代謝水平，在胃腸道疾病、代謝疾病、自身免疫性疾病、神經系統疾病中起著重要的作用，被認為是人體又一重要“器官”[8-10]。大部分腸道菌群與宿主相互作用、相互影響，共同維持腸道菌群的平衡。高脂飲食可導致腸道菌群改變，引發腸軸膜中緊密連接蛋白zo-1、occiudin變化，從而促進腸道通透性增加，損害腸軸膜屏障，促進內毒素吸收入血[11]。

表2　各組血TC、TG、TNF－α及內毒素指標比較（±s，n＝10）

表2　各組血TC、TG、TNF－α及內毒素指標比較（±s，n＝10）

注：與HGB比較，t=-0.222，aP=0.000；t=-0.173，cP=0.014；t=-15.281，eP=0.000；t=-0.008，gP=0.011；與NG比較，t=0.629，bP=0.000；t=0.362，dP=0.000；t=15.841，fP=0.000；t=0.016，hP=0.000

組別　n　TCTGTNF-αEndotoxin （mmol/L）　（mmol/L）　（pg/mL）　（EU/mL）NG101.83±0.070.91±0.1822.17±4.920.041±0.009 HGA92.46±0.08ab1.27±0.11cd38.01±3.78ef0.057±0.005ghHGB92.68±0.171.44±0.0953.29±3.300.066±0.005 F值146.8636.84137.1633.12 P ＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

腸道菌群產生的內毒素在肥胖及代謝紊亂過程中發揮重要作用。研究發現，葛蘭陰性菌的產物內毒素是代謝性疾病的早期觸發因素，并且起到級聯放大作用[12]。內毒素通過LPS/CD14信號通路引發慢性炎癥反應，導致肥胖及胰島素抵抗。另外，內毒素能夠誘導巨噬細胞M1亞型，使其聚集到凋亡脂肪細胞及肝細胞，釋放促炎因子[13]。Cani[14]發現，高脂肪喂養4周的小鼠血漿內毒素濃度升高了2～3倍，血漿中內毒素濃度的增加與腸道菌群的變化（革蘭陰性菌與革蘭陽性菌在高脂肪喂養時比例增加）密切相關。之后又有學者發現，抗生素治療能夠降低高脂喂養小鼠腸道革蘭氏陰性菌比例及腸道血漿內毒素水平，并且能夠改善糖耐量，減少體重增加[15，16]。

且肥胖動物體內過多產生的炎性因子如TNF-α，IL-1β，IL-6以及MCP-1能夠加重慢性炎癥和胰島素抵抗[17]。TNF-α能夠降低胰島素的敏感性，具有促炎作用[18]。而胰島素抵抗是肥胖和二型糖尿病發病機制的一個共同特征。任瑞珍等利用放射免疫法檢測70例2型糖尿病患者和60例健康對照者空腹血清胰島素、TNF-α水平，發現2型糖尿病患者TNF-α高于正常者且與胰島素抵抗指數呈正相關[19]。

綜上所述，如何改善腸道菌群結構是防治肥胖的關鍵環節之一。我國最早應用糞菌移植治療疾病，早在1700年前，葛洪[20]就將其應用于腹瀉患者。發表于新英格蘭醫學雜志的一項大型隨機、對照試驗證實，FMT治療難治性C.difficile的作用[21]。本研究發現，高脂飲食誘導的肥胖大鼠與正常大鼠相比，血漿內毒素和TNF-α均明顯增高。經FMT治療后，血內毒素明顯下降，TNF-α水平也顯著下降，提示FMT能夠糾正腸道微生態，增強腸道屏障功能，降低血內毒素及炎癥因子水平。FMT增強腸道屏障功能以及治療肥胖的具體機制仍需進一步研究，但這也可能為今后肥胖以及代謝綜合征的治療提供一種新的治療途徑。不過，實驗中FMT并未能將肥胖體重、血脂以及血漿內毒素完全降至正常水平，這也提示我們，改善生活習慣，合理飲食、積極鍛煉仍是十分必要的減肥方法。

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·內科醫學·

Effects of fecal microbiota transplantation on lipidemia and gut barrier in diet-induced obesity rats

GUO Shangqi1WU Hua2ZHAI Chunbao3CHENG Gong1CAI Jingrong1
1.Shanxi Medical University，Taiyuan030001，China；2.Department of General Surgery,the First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan030001，China；3.Department of General Surgery,Shanxi Province People's Hospital，Taiyuan030001，China

[Abstract]Objective To explore the influence of fecal microbiota transplantation(FMT)on lipidemia and gut barrier in rats with diet-induced obesity.Methods Forty SD male rats were randomly divided into three groups：normal control group（NG group;fed a normal diet for 6 weeks），two high-fat diet groups（HGA and HGB groups;fed a high-fat diet for 6 weeks).HGA group recieved fecal microbiota transplantation；The rats in NG and HGB group were given normal saline enema，once a week，continuous enema administration for 3 weeks.Changes in the body weight and Lee index were measured at the end of the sixth-and ninth-week.At the end of ninth-week,the concentration of endotoxin, TNF-α,TC and TG in blood were detected.Liver index were measured and the liver tissue samples were collected for pathology examination.Results The body weight of high-fat group significantly increased in the during the modeling (P<0.05).Compared with the HGB group,Lee index,liver index,the concentration of endotoxin,TNF-α,TC and TG in blood of rats in HGA group remarkably decreased at the end of the ninth-week.Conclusion FMT could ease endotoxemia，decrease liver steatosis gradings and lipidemia.

[Key words]Diet-induced obesity;Fecal microbiota transplantation;Gut barrier;Gut microbiota

[中圖分類號]R574.4

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-9701（2016）04-0025-03

收稿日期：（2015-11-20）