Jak2v617f基因過表達及SAA患者血清對小鼠32D細胞體外培養中細胞因子濃度的影響

張宇明　李寧　吳國才　聶麗容　何紅華　彭曉東.廣東醫學院附屬醫院血液內科，廣東湛江　54000；.廣東醫學院附屬醫院急診科，廣東湛江　54000

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Jak2v617f基因過表達及SAA患者血清對小鼠32D細胞體外培養中細胞因子濃度的影響

張宇明1李寧1吳國才1聶麗容1何紅華1彭曉東2
1.廣東醫學院附屬醫院血液內科，廣東湛江524000；2.廣東醫學院附屬醫院急診科，廣東湛江524000

[摘要]目的觀察Jak2v617f轉染小鼠32D細胞后，與重癥再生障礙性貧血患者（severe aplastic anemia，SAA）血清共培養，了解Jak2v617f對SAA患者血清細胞因子水平的影響。方法利用DNA克隆技術，將mutJAK2（v617f）慢病毒轉染至32D細胞，檢測未轉染組與轉染組細胞分別與正常血清與SAA患者血清培養后，血清細胞因子（IL-2、CD69、IFN-γ、TNF-α）水平的變化；同時觀察未轉染組細胞與SAA患者血清培養，加入Jak2抑制劑AZD148后，上述血清細胞因子水平的變化。結果SAA組（SAA血清+32D）與對照組（正常血清+32D）比較，血清細胞因子CD69差異無統計學意義（P>0.05），SAA組IL-2、IFN-γ則下降（P<0.05），TNF-α下降更明顯（P<0.01）；Jak2v617f組（Jak2v617f+正常血清+32D）則相反，除TNF-α外，余血清細胞因子水平均顯著高于對照組（P均< 0.01）；Jak2v617f+SAA組（Jak2v617f+SAA血清+32D）除CD69較對照組顯著升高外（P<0.01），余與對照組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）；AZD148組（正常血清+32D+Jak2抑制劑）與對照組比較，除CD69（P>0.05）外，余細胞因子均較對照組減少（P<0.05或P<0.01）；SAA+AZD148組（SAA血清+32D+Jak2抑制劑）與對照組比較，除CD69較對照組顯著升高（P<0.01）外，余均顯著減少（P均<0.01）。結論小鼠32D細胞Jak2v617f基因的過表達，有利于彌補SAA血清細胞因子的消耗；小鼠32D細胞加入Jak2抑制劑則有可能加重SAA血清細胞因子的消耗。

[關鍵詞]Jak2v617f；轉染；SAA；細胞因子；AZD148

Jak2v617f基因突變多見于BCR-ABL陰性的骨髓增殖性腫瘤（myeloproliterative neoplasms，MPN），該病的臨床表現主要有白細胞增多、血紅蛋白增多及血小板增多等多血癥的表現，也可出現血栓及出血[1，2]；再生障礙性貧血的臨床表現則剛好相反，它主要表現為白細胞減少、血紅蛋白減少、血小板減少等骨髓衰竭的表現。Jak2v617f是骨髓增殖性腫瘤的致病因素[3，4]，而細胞因子則是再生障礙性貧血的致病因素[5]。本文探討將此兩種致病因素加以整合，能否將兩者的致病作用相抵消，現報道如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選擇2012年6月～2015年3月我院初治的SAA患者血清6例，均符合《血液病診斷及療效標準》（第3版）中的診斷標準。其中，男3例、女3例，年齡22～45歲。同期選擇我院健康體檢者血清6例，其中男3例、女3例，年齡25～45歲。

1.2實驗材料

mutJAK2（v617f）慢病毒由廣州萊德爾生物科技有限公司協助制備；小鼠32D細胞由廣州萊德爾生物科技有限公司提供；實驗試劑：胎牛血清（Hyclone，Cat.No.SH30087.01），RPMI-1640培養基（Hyclone，Cat.No.SH30809.01B）；Mouse IL-2 Platinum ELISA（e bioscience，Cat.No.BMS601）；MouseCD69Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS614/2）；Mouse IFN-γ Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS606）；Mouse TNF-α Platinum ELISA（ebioscience，Cat.No.BMS607/3）。

1.3實驗儀器

蘇州安泰潔凈工作臺（SW-CJ-IFD），低速離心機（中佳，SC3614），倒置光學顯微鏡（OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2），細胞恒溫培養箱（Thermo scientific，HERA CELL150i），倒置熒光顯微鏡（Leica，DMI6000B），流式細胞儀（BD，calibur）。

1.4實驗方法

感染實驗：將2×104L個32D細胞接種于96孔板，體積為100 μL，以第2天密度約50%左右為宜，37℃培養過夜；次日，從冰箱取出mutJak2（v617f）慢病毒，并在37℃水浴中快速融化（輕輕晃動約幾秒，以溶化液體中有少量冰塊為宜，立即取出），并立即用事先加熱到37℃的新鮮完全培養基（使用前加入Polybrene，終濃度6 mg/mL）加入2×106TU病毒（病毒濃度由預實驗確定），輕輕混勻；吸去32D細胞原有培養基，將稀釋好的病毒液加入細胞中；輕搖勻，37℃培養過夜；感染后第2天，吸去含病毒的培養液，換上新鮮的完全培養液（不含Polybrene），繼續37℃培養；感染后第3天，觀察GFP表達。另外，分別將2×105L個32D細胞接種于24孔板，按上述步驟加入慢病毒，準備以下實驗。

1.5實驗分組

實驗分6組：對照組即小鼠32D細胞在含正常血清的培養基培養；SAA組即小鼠32D細胞在含SAA患者血清的培養基培養；Jak2v617f組即過表達Jak2v617f的小鼠32D細胞在含正常血清的培養基培養；Jak2v617f+SAA組即過表達Jak2v617f的小鼠32D細胞在含SAA患者血清的培養基培養；AZD148組即小鼠32D細胞在含正常血清及Jak2抑制劑培養基培養；SAA+AZD148組即小鼠32D細胞在含SAA患者血清及Jak2抑制劑培養基培養。

1.6推算直線方程

制定IL-2、CD69、IFN-γ、TNF-α等標準品的濃度曲線并推算直線方程。

1.6.1標準品稀釋應用雙蒸水稀釋液重溶IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α標準品，重溶后標準品的濃度為500 pg/mL，重溶后靜置10～30 min，稀釋前充分混勻。

1.6.2分別制定IL-2的標準曲線，推算直線方程吸取225 μL樣本稀釋液到7個管，吸移225 μL重溶標準品（500 pg/mL）到第1管，標記為S1（250 pg/mL），吸取225 μL此稀釋到第2管中，標記為S2（125 pg/mL），重復連續稀釋液產生標準曲線的點（圖1）。樣本稀釋液作為空白。

圖1　樣本連續稀釋圖

1.6.3推算直線方程同法制定CD69、IFN-γ及TNF-α標準曲線及推算直線方程。

1.7血清IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α檢測

應用ELISA法檢測各組樣本血清IL-2、CD69、IFN-γ及TNF-α的濃度。

1.7.1具體步驟加入100 μL標準品到標準品孔、100 μL樣本稀釋液到空白孔、50 μL樣本稀釋液到樣品孔、50 μL樣本到樣本孔，每組重復3管；所有孔加入50 μL生物素標記檢測抗體，使用封板膜封板，400轉/min振蕩，室溫孵育2 h，棄掉液體，400 μL洗液洗板3次，加入400 μL洗液靜置浸泡10～15 s；加入100 μL/孔辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素到所有孔，使用封板膜封板；400轉/min振蕩，室溫孵育1 h，棄掉液體，400 μL洗液洗板3次；加入400 μL洗液靜置浸泡10～15 s；加入100 μL/孔TMB顯色液，室溫避光反應10 min，每孔加入100 μL終止液終止反應。

1.7.2酶標儀測定設定酶標儀450 nm，波長測定OD值，參考波長設定為620 nm。

1.8統計學分析

采用SPSS 13.0統計學軟件數據分析，所有數據均用均數±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1鼠IL-2 ELISA檢測

根據IL-2的OD值與濃度的關系，繪制直線見圖2，并得到直線方程：y=0.0117x+0.1914，其中y代表OD值，x代表濃度（con），將各實驗組OD值換算成濃度見表1，結果顯示：SAA組、AZD148組（Jak2抑制劑）及SAA+AZD148組與對照組比較，血清IL-2水平均減少，差異具有統計學意義（前者P<0.05），后兩組降低趨勢差異有高度統計學意義（P<0.01）；Jak2v617f組及SAA+Jak2v617f組則相反，IL-2水平較對照組高，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1、圖2、3。

表1　鼠IL-2 ELISA檢測及數據分析

圖2　鼠IL-2 ELISA標準曲線

圖3　各組樣品檢測IL-2含量比較

2.2鼠CD69 ELISA檢測

利用2.1的檢測方法，同理得出以下實驗結果見表2、圖4、5：與對照組比較，血清CD69水平除Jak2v617f組升高外（P<0.01），SAA組、SAA+Jak2v617f組、AZD148組（Jak2抑制劑）、SAA+AZD148組與對照組比較，CD69水平均下降（前兩組P<0.05，后兩組P< 0.01），見圖4、5。

圖4　鼠CD69 ELISA標準曲線

圖5　樣品檢測鼠CD69含量比較

表2　鼠CD69 ELISA檢測及數據分析

2.3鼠IFN-γ ELISA檢測

利用2.1的檢測方法，同理得出以下實驗結果見表3、圖6、7：與對照組比較，血清IFN-γ水平除Jak2v617f組升高外（但P>0.05），SAA組、SAA+AZD148組、SAA+Jak2v617f組及AZD148組（Jak2抑制劑），與對照組比較，IFN-γ水平均下降（前兩組P<0.01，后兩組P<0.05）。

表3　鼠IFN-γ ELISA檢測及數據分析

圖6　鼠IFN-γ ELISA標準曲線

圖7　樣品檢測鼠IFN-γ含量

2.4鼠TNF-α ELISA檢測

利用2.1的檢測方法，同理得出以下實驗結果見表4、圖8、9：與對照組比較，血清TNF-α水平除SAA+ AZD148組（P<0.05）及AZD148組（P<0.01）與對照組比較升高外，SAA組、Jak2v617f組及SAA+Jak2v617f 組TNF-α水平均下降（P均<0.05）。

3　討論

重癥再生障礙性貧血是血液系統的危重疾病，骨髓呈嚴重的衰竭狀態，其藥物起效慢甚或無效，雖然治療方面造血干細胞移植技術取得了很大進步[6，7]，但由于患者經濟能力、年齡、病情嚴重程度等種種原因，仍有相當一部分患者難以挽回生命；而血液系統的另一種疾病骨髓增殖性腫瘤，疾病狀況與再障則剛好相反，骨髓各系細胞顯著增生，本課題研究旨在探討上述兩病的致病因素共存時，其致病作用能否得以緩和。

表4　鼠TNF-α ELISA檢測及數據分析

圖8　Mouse TNF-α ELISA標準曲線

圖9　樣品檢測鼠TNF-α含量

本課題組之前的研究證實，重癥再障患者的血清可抑制小鼠32D細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，相反，轉染了Jak2v617f的小鼠32D細胞的增殖力則增強，細胞凋亡則減少，這些結論均與文獻報道相仿[8-10]；另外將轉染了Jak2v617f的小鼠32D細胞置于含重再患者血清的培養基中培養，即將兩種致病因素加以整合，兩者的致病作用相互抵消，細胞的增殖力及凋亡數趨向正常，這些數據將在另文報道[11]。

本實驗研究結果顯示：小鼠32D細胞用重癥再障患者血清進行體外培養，檢測血清白介素-2（IL-2）、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及CD69含量均較正常對照組減少，與文獻報道不一致，重復實驗結果也類似。既往研究顯示[12]，T細胞的免疫激活是再生障礙性貧血的發生、發展的關鍵環節，T細胞激活后，由于其功能處于亢進狀態，能分泌大量的細胞因子如IL-2、IFN-γ、TNF-α等，這些負調節因子作為一種致病因素將導致造血干細胞的損傷及增殖能力減退，并誘導造血干細胞的凋亡，進而引起骨髓衰竭即再障的發生；許多研究者也通過相關實驗[13，14]證實再障患者體內IL-2、IFN-γ、TNF-α因子水平及CD69含量是升高的；本實驗研究中IL-2、IFN-γ、TNF-α因子水平及CD69含量的減少可能由于重再患者血漿中的這些細胞因子作為致病因素，也能在體外作用于小鼠32D細胞，導致其類似再障的改變：比如增殖力減弱、凋亡增多等，并在此過程中上述細胞因子被消耗，而體外缺乏活化的T細胞，這些細胞因子難以持續分泌，故而減少。

本實驗研究還顯示：小鼠32D細胞轉染了Jak 2v617f基因后用正常血清培養，血清中IL-2、IFN-γ水平及CD69含量較對照組高，TNF-α則減少，小鼠32D細胞在正常血清培養時，如加入Jak2抑制劑AZD148，則這四種細胞因子濃度剛好相反，除TNF-α升高外，其他三種均降低。Jak2v617f作為骨髓增殖性腫瘤的致病基因，其致病機制主要由于位于JH2區617位的纈氨酸被分子量更大苯丙氨酸取代，導致原折疊區域被打開，JH1活化環相互接近，Jak2持續活化，細胞對生長因子的敏感性增高，甚至在細胞因子不存在時，也能通過Jak2的活化及生長因子受體的作用，使細胞更多向紅細胞、白細胞、血小板轉化[15，16]；相反，加入Jak2抑制劑則有利于減少紅細胞、白細胞及血小板的數目[17,18]。本文推測，與此同時，也存在對負調節因子敏感性降低的情況，IL-2、IFN-γ水平及CD69等因子被利用減少，另外Jak2活化，也可導致STATS及其下游激酶的改變，使細胞凋亡減少，遂導致IL-2、IFN-γ水平及CD69水平升高；也有可能某一途徑激活后，這些因子分泌增多；TNF-α水平可能更為依賴于T細胞的活化，本實驗活化T細胞較少，故TNF-α水平減低。如轉染Jak2v617f基因的小鼠32D細胞加入重癥再障患者血清培養，則在體外培養過程中，血清中上述細胞因子濃度趨向正常,說明這兩種治病因素共存時，其致病作用得到抵消；如小鼠32D細胞在Jak2抑制劑AZD148及重癥再障患者血清共存的環境下培養，上述細胞因子進一步下降，說明Jak2抑制劑AZD148有可能加重重癥再障血清的致病作用。目前國內外類似研究甚少，其機制尚不清楚，有待進一步的研究證實。

[參考文獻]

[1]Jan Jacques Michiels，Fibo Ten Kate，King H Lam，et al. The European clinical，molecular，and pathological（ECMP）criteria and the 2007/2008 revisions of the World Health Organization for the diagnosis，classification，and staging of prefibrotic myeloproliferative neoplasms carrying the JAK2V617F mutation[J].Turk J Haematol，2014，31（3）：239-254.

[2]Camilla Nielsen，Stig E Bojesen，B?rge G，et al.JAK2V617F somatic mutation in the general population：Myeloprolifer ative neoplasm development and progression rate[J].Haematologica，2014，99（9）：1448-1455.

[3]吳蔚，顧健，王紅，等.骨髓增殖性腫瘤患者JAK2V617F基因突變及凝血功能研究[J].血栓與止血學，2013，19 （5）：193-196.

[4]趙蘭濱，申蓮玉.JAK2V617F基因檢測在骨髓增生性疾病診斷及預后判斷中的意義[J].中國當代醫藥，2013，20 （1）：4-5.

[5]Scheinberg P.Aplastic anemia：therapeutic updates in immunosuppression and transplantation[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program，2012，2012：292-300.

[6]Seung Hwan Shin，Sung Eun Lee，Jong Wook Lee.Recent advances in treatment of aplastic anemia[J].Korean J Intern Med，2014，29（6）：713-726.

[7]Qingqing Wu，Jizhou Zhang，Jun Shi，et al.Increased bone marrow（BM）plasma level of soluble CD30 and correlations with BM plasma level of interferon（IFN）-γ，CD4/ CD8 T-cell ratio and disease severity in aplastic anemia[J]. PLoS One，2014，9（11）：e110787.

[8]Alexandra D，Cline M，Christian P，et al.JAK2 V617F constitutive activation requires JH2 residue F595：A pseu dokinase domain target for specific inhibitors[J].PLoS One，2010，5（6）：e11157.

[9]Williams DM，Kim AH，Rogers O，et al.Phenotypic variations and new mutations in JAK2 V617F-negative poly cythemia vera，erythrocytosis，and idiopathic myelofibrosis[J]. Exp Hematol，2007，35（11）：1641-1646.

[10]楊小飛，劉紅，錢軍，等.再生障礙性貧血患者血清對小鼠髓系前體細胞凋亡及蛋白激酶B表達的影響[J].山東醫藥，2010，50（11）：4-5.

[11]張宇明，李寧，吳國才，等.重癥再生障礙性貧血患者混合血清對轉染Jak2v617f小鼠32D細胞的影響[J].廣東醫學，2015，36（22）：3434-3437.

[12]Xingmin Feng，Phillip Scheinberg，Colin O Wu，et al.Cytokine signature profiles in acquired aplastic anemia and myelodysplastic syndromes[J].Haematologica，2011，6（4）：602-606.

[13]王成紅，姚晨姣，唐雪元，等.再障患者血清IL-2、TNF-α、IFN-γ和外周血T淋巴細胞亞群變化研究[J].現代生物醫學進展，2012，36（12）：7077-7079.

[14]張磊，薛軍，蘇愛玲，等.再生障礙性貧血血清IL-2、TNF-α、sFas、IFN-γ及外周血T淋巴細胞亞群變化研究[J].現代預防醫學，2011，38（24）：5135-5136.

[15]Bogeska R，Pahl HL.Elevated nuclear factor erythroid-2 levels promoteepo-independent erythroid maturation and recapitulate the hematopoietic stem cell and co mmon myeloidprogenitorexpansionobservedinpolypolycythemia vera patients[J].Stem Cells Transl Med，2013，2 （2）：112-117.

[16]Ye Z，Liu CF，Lanikova L，et al.Differential sensitivity to JAK inhibitory drugs by isogenic human erythroblasts and hematopoietic progenitors generated from patientspecific induced pluripotent stem cells[J].Stem Cells，2014，32（1）：269-278.

[17]Y Nakaya，K Shide，H Naito，T Niwa，et al.Effect of NS-018，a selective JAK2V617F inhibitor，in a murine model of myelofibrosis[J].Blood Cancer J，2014，4（1）：e174.

[18]Mascarenhas J，Mughal TI，Verstovsek S.Biology and clinical management of myeloproliferative neoplasms and development of the JAK inhibitor ruxolitinib[J].Curr Med Chem，2012，19（26）：4399-4413.

Influence of Jak2v617f overexpression and SAA patients'serum on cytokines concentrations in mice 32D cells in vitro culture

ZHANG Yuming1LI Ning1WU Guocai1NIE Lirong1HE Honghua1PENG Xiaodong2
1.Internal Hematology Department,the Affliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang524000,China;
2.Emergency Department,the Affliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang524000,China

[Abstract]Objective To observe Jak2v617f-transfected mice 32D cells which were co-cultured with severe aplastic anemia(SAA)patients'serum and to understand the impact of Jak2v617f on cytokines levels in SAA patients'serum. Methods DNA cloning technology was used to transfect the mutJak2(v617f)lentivirus into 32D cells,and changes of serum cytokines(IL-2,CD69,IFN-γ,changes in TNF-α)levels were detected after the untransfected group cells and the transfected cells were co-cultured with normal serum and SAA patients'serum respectively.And in the same time, changes of the serum cytokines levels were detected after the untransfected group cells were co-cultured with SAA patients'serum and Jak2 inhibitor ADZ148 was added to them.Results There was no significant difference in comparing serum cytokine CD69 of the SAA group(SAA serum+32D)and the control group(normal serum+32D)(P>0.05).Compared with the control group,IL-2,IFN-γ in SAA group decreased(P<0.05),and TNF-α in SAA group decreased more significantly(P<0.01).On the contrary,the remaining serum cytokines levels of the Jak2v617f group(Jak2v617f+normal serum+32D)were significantly higher than those of the control group,in addition to TNF-α(P<0.01).The increase of CD69 in the Jak2v617f+SAA group(Jak2v617f+SAA serum+32D)was significantly higher than that in the control group (P<0.01),and there were no significant differences in comparing other serum cytokines levels of the Jak2v617f+SAA group and the control group(P>0.05).Compared with the control group,the other cytokines of AZD148(normal serum+ 32D+Jak2 inhibitor)excepted for CD69(P>0.05)increased(P<0.05，or P<0.01).Compared with the control group,CD69 of the SAA+AZD148 group(SAA serum+32D+Jak2 inhibitor)significantly increased(P<0.01),but the other cytokines significantly reduced(P<0.01).Conclusion Overexpression of mice 32D cells gene Jak2v617f can help make up for the consumption of SAA serum cytokines and mice 32D cells with Jak2 inhibitor are likely to increase the consumption of SAA serum cytokines.

[Key words]Jak2v617f;Transfection;SAA;Cytokine;AZD148

[中圖分類號]R556.5

[文獻標識碼]A

[文章編號]1673-9701（2016）04-00019-06

[基金項目]廣東省科技計劃項目（2011B031800344）

收稿日期：（2015-11-27）