土壤中木霉的分離及其對毒死蜱降解特性研究

張廣志 張新建 李紅梅 郭凱 楊合同

（山東省科學院生態研究所 山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250014）

土壤中木霉的分離及其對毒死蜱降解特性研究

張廣志 張新建 李紅梅 郭凱 楊合同

（山東省科學院生態研究所 山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250014）

為挖掘保護地土壤中的能降解毒死蜱的木霉資源，從長期污染的土壤中共分離6個不同木霉菌株，通過形態學特征和ITS rDNA序列對各菌株進行鑒定，6個菌株分別為哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、綠色木霉（T. viride）、康寧木霉（T. koningii）、擬康寧木霉（T. koningiopsis）、長枝木霉（T. longibrachiatum）和短密木霉（T. brevicompactum）。選擇降解活性最高的長枝木霉TC5菌株，測定各種條件下對毒死蜱的降解特性。結果表明，木霉TC5在中性或偏堿性條件下對毒死蜱具有更好的降解活性；添加碳源或提高木霉的接種濃度，能提高對毒死蜱的降解活性；在50-300 mg/L范圍內，隨毒死蜱濃度升高，木霉的降解活性也明顯提高。盆栽試驗中木霉TC5對毒死蜱保持較強的降解活性，但在自然土壤中降解活性顯著低于在滅菌土壤中。分離的木霉菌株在土壤農藥污染修復方面具有應用開發潛力。

木霉；毒死蜱；生物降解

我國設施蔬菜產業發展迅速，由于其適宜的溫濕度及連作等眾多原因，病蟲害發病日益嚴重，殺蟲劑的使用也在逐年增加，土壤環境中農藥殘留嚴重。其中毒死蜱就是其中一種廣譜殺蟲且應用廣泛的有機磷殺蟲劑，在土壤中的半衰期通常在60-120 d，甚至會超過1年［1］。毒死蜱具有較高的急性毒性，影響中樞神經系統、心血管系統和呼吸系統，也能引起皮膚和眼睛過敏，在農業上的廣泛使用增加了對公眾安全的威脅［2］。利用生物或生物產品來降解污染物的生物修復方法具有無毒、無殘留、無二次污染等優點，是消除和解毒高濃度的農藥殘留的一種安全、有效、廉價的方法［3］。目前報道的能降解毒死蜱的降解菌來源主要是被農藥污染的土壤或農藥廠污泥［4］，種類主要是細菌，如假單胞菌（Pseudomonas sp.）、鄰單胞菌（Plesiomonas sp.）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、節桿菌（Arthrobacter sp.）、產堿桿菌（Alcaligenes sp.）、哈夫尼菌（Hafnia sp.）、沙雷氏菌（Serratia sp.）、鞘脂單胞菌（Sphingomonas sp.）、羅爾斯通菌（Ralstonia sp.）、克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、普羅維登斯菌（Providencia sp.）等［4］。部分真菌也可以降解有機磷農藥，如曲霉（Aspergillus sp.）、輪枝孢（Verticillium sp.）、鐮孢菌（Fusarium sp.）［5-7］，也有關于木霉菌（Trichoderma sp.）的報道［6］。

木霉是土壤微生物的優勢種群，一直作為生防菌被廣泛研究和應用，近來的研究表明木霉在土壤和水源污染（如農藥等有機物污染或重金屬污染）修復方面表現巨大的應用潛力［6］。本研究從長期施藥的韭菜溫室土壤里分離能降解毒死蜱的木霉，并對其降解特性進行初步研究，旨在為土壤中農藥殘留的污染修復提供借鑒參考。

1 材料與方法

1.1 材料

毒死蜱標準品（≥99.5%），北京上立方聯合化工技術研究院提供。毒死蜱原藥（≥95%），山東天成生物技術有限公司提供。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 木霉分離及鑒定 土樣采自山東多年種植韭菜的日光溫室（韭蛆發病嚴重，毒死蜱和其他多種有機磷農藥頻繁，大量施用）。通過兩種途徑獲得木霉菌株。方法A（富集培養［8］）：將1.0 g土樣接種到含有50 mL 無機鹽液體培養基（MSM：K2HPO41.50 g，KH2PO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，（NH4）2SO40.50 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，CaCl20.04 g，NaC l0.5 g，H2O 1 000 mL，pH7.0。滅菌后加入50 mg/L 毒死蜱原藥作為唯一碳氮源）的250 mL三角瓶里，140 r/min，25℃培養7 d；取1 mL 培養物轉接入含有100 mg/L 毒死蜱原藥的同樣條件的無機鹽培養基里，同上條件培養；并依次提高毒死蜱濃度至150 mg/L、200 mg/L。最后，將培養物稀釋、涂板至MSM固體培養基上，25℃培養2-3 d，挑取類似木霉菌株，純化，去同，保存。

方法B：直接將土樣用無菌水稀釋，涂在含有100 mg/L 毒死蜱原藥的MSM固體培養基上，25℃培養2-3 d，挑取類似木霉菌株，純化，去同，保存。

結合形態學特征和ITS rDNA序列對木霉進行初步鑒定［9］。

1.2.2 木霉對毒死蜱降解能力的初步測定 按100 mg/L的濃度含量將毒死蜱加入到滅菌后的裝有50 mL無機鹽液體培養基（MSM）的250 mL三角瓶中，分別接種各菌株木霉孢子懸液（1.0×108CFU/mL）1 mL，以不接木霉孢子懸液的處理為對照。每處理重復3次，置于30℃ 140 r/min 培養5 d，每隔1 d全取樣1次，并利用GC-ECD法檢測毒死蜱殘留量［10，11］。并選擇降解活性最高的木霉菌株進行降解特性研究。

1.2.3 添加碳源對木霉降解毒死蜱活性的影響 將0.05 g 葡萄糖加入到含有50 mL 無機鹽液體培養基（滅菌后加入100 mg/L毒死蜱）的250 mL三角瓶中。接種1 mL待測菌株的孢子懸液（1.0×108CFU/mL），置于30℃ 140 r/min 培養5 d，隔1 d全取樣1次，檢測毒死蜱殘留量，以不加葡萄糖的處理為對照。

1.2.4 接種濃度對木霉降解毒死蜱的影響 3種不同濃度的的木霉孢子懸液（1.0×107CFU/mL，1.0×108CFU/mL和1.0×109CFU/mL）分別接種到上述含有毒死蜱的無機鹽液體培養基中。未接種木霉的處理作為對照。培養條件及檢測方法同上。

1.2.5 底物濃度對木霉降解毒死蜱的影響 不同濃度的毒死蜱（50 mg/L，100 mg/L，150 mg/L，200 mg/L，250 mg/L和 300 mg/L）加入到MSM液體培養基中，接種1 mL 同一木霉孢子懸液（1.0×108CFU/ mL）。同上條件下培養，并取樣檢測木霉含量。以未接木霉的處理為對照。

1.2.6 pH對木霉降解毒死蜱的影響 將無機鹽液體培養基分設pH5、pH6、pH7、pH8、pH9等5個不同梯度，滅菌后加入100 mg/L毒死蜱，再接種1 mL待測木霉孢子懸液（1.0×108CFU/mL），連續培養5 d，同上全取樣，檢測毒死蜱殘留量。

1.2.7 盆栽條件下木霉對毒死蜱的降解效果 2014年6月在單位東區溫室內進行盆栽試驗。土壤取自壽光市孫家集鎮西候村日光溫室，實驗用塑料瓶（18 cm×15 cm×15 cm），每盆裝土壤1 kg。處理分設兩組，A組121℃濕熱滅菌2 h，B組不滅菌，按100 mg/kg的量添加毒死蜱，混拌均勻并吸附24 h。A、B組設各2個處理：（1）加1.0×106CFU/mL）木霉TC5孢子懸液；（2）加1.0×108CFU/mL）木霉TC5孢子懸液；以不加菌劑的為對照，每處理3次重復，每盆種番茄種類5粒（出苗后統一留下3棵），木霉孢子懸液以完全浸透盆內土壤為準。溫室內自然條件下培養2周，采用GC-ECD的方法，取土樣測定毒死蜱殘留量［11］。

2 結果

2.1 毒死蜱降解木霉的分離及鑒定

通過兩種分離途徑，共分離6個不同的木霉菌株。其中，通過富集培養的方式，最終分離4個木霉菌株，編號TC1-TC4；而直接通過稀釋平板法，分離得到另外2個木霉菌株，編號TC5和TC6。結果表明，長期使用有機磷農藥的土壤中，降解毒死蜱的木霉菌資源豐富；且不同的分離方法，獲得不同的木霉菌株，也顯示各木霉菌在土壤中具有不同的種群密度以及競爭優勢。結合形態學特征和ITS rDNA序列對木霉進行初步鑒定，TC1-TC6分別屬于哈茨木霉（T. harzianum）、綠色木霉（T. viride）、康寧木霉（T. koningii）、擬康寧木霉（T. koningiopsis）、長枝木霉（T. longibrachiatum）和短密木霉（T. brevicompactum）。

2.2 木霉對毒死蜱的降解能力測定

在搖瓶培養的條件下，測定木霉對毒死蜱的降解能力。結果如圖1所示，各木霉菌株對毒死蜱的降解曲線大致相同。木霉在接種后24 h內即開始發揮降解作用，沒有觀察到Karpouzas和Anwar等［1］描述的滯后期，表明木霉在較低生長量時就能表現明顯的降解活性，降解效率更高。24 h后，各菌株的降解活性迅速提高，此時觀察搖瓶中木霉生物量也迅速增多。3 d后，隨著毒死蜱濃度的降低，木霉對其降解活性也放慢。5 d后，各處理毒死蜱的含量分別降為7.50±1.67 mg/L、10.90±2.50 mg/L、9.00±2.30 mg/L、11.93±3.15mg/L、2.00±1.50mg/L和8.55±2.58 mg/L，降解率均在87%以上；菌株間差別不大，其中TC5菌株（長枝木霉）降解活性最高，對毒死蜱的降解率達到97.93%。

圖1 木霉對毒死蜱的降解作用

2.3 外加碳源對木霉降解毒死蜱的影響

接種木霉TC5菌株 24 h后，添加1.0 g/L葡萄糖，毒死蜱降為71.67±4.48 mg/L，降解率為26.85%，高于未添加碳源的處理16.82%的降解率。添加碳源能明顯提高木霉對毒死蜱的降解效率（圖2）。2 d后，添加碳源的處理毒死蜱降解為30.5±3.53 mg/L，而未添加碳源的毒死蜱為55.5±4.47 mg/L，降解率分別為68.88%和43.37%，添加碳源提高降解率58.82%。之后，添加碳源的處理降解速率趨于平緩，而未加碳源的處理降解速率加速，3 d后也開始降低，趨勢與添加碳源的處理相同。5 d后，添加碳源，毒死蜱降為1.85±1.19 mg/L，略低于未加碳源3.8±1.86 mg/L的殘留量，降解率分別為98.05%和96%，差異不明顯。表明添加碳源，主要通過快速提高木霉的生長，從而提高對毒死蜱的降解率，最終對毒死蜱的降解效率差異不明顯。

2.4 接種濃度對木霉降解毒死蜱的影響

接種不同濃度的木霉孢子懸液，對木霉TC5菌株降解毒死蜱的能力影響明顯。如圖3所示，加大接種濃度，能加快木霉對毒死蜱的降解，2 d后，接種不同接種濃度（A：1.0×107CFU/mL，B：1.0×108CFU/mL，C：1.0×109CFU/mL）木霉孢子，毒死蜱分別降解至72.84±4.04 mg/L、56.97±5.03 mg/L和40.61±4.28 mg/L，降解率分別為26.4%、43.4%和59.8%；從圖中也可以看出，高接種濃度情況下，對毒死蜱的降解速率明顯高于低接種濃度的處理。而低接種濃度的降解速率在2 d后，隨著木霉生物量的增加，也逐漸提高，并開始高于高接種濃度的處理，此時高接種濃度的降解率隨著毒死蜱底物濃度的降低而逐漸放緩。這與通過添加碳源提高木霉生長量，從而提高降解毒死蜱的速度原理基本一致。

圖2 外加碳源對木霉降解毒死蜱活性的影響

圖3 接種濃度對木霉降解毒死蜱的影響

2.5 底物濃度對木霉降解毒死蜱的影響

木霉TC5對不同毒死蜱濃度的降解效果如圖4所示，具有明顯的差異。對高濃度的毒死蜱底物，降解效率也相應升高。在50、100、150、200、250和 300 mg/L不同底物濃度條件下，降解后的毒死蜱殘留分別為12.93±1.79 mg/L、4.42±0.91 mg/L、5.45±0.80 mg/L、3.63±1.50 mg/L、5.43±1.23 mg/L和3.30±0.36 mg/L，降解率分別為72.77%、95.44%、96.23%、98.14%、97.79%和98.86%。由此表明，在低濃度范圍內，隨著毒死蜱底物濃度的升高，降解率也有顯著提高。在高濃度（200 mg/L、250 mg/L和300 mg/L）條件下，處理間差異不顯著。

圖4 底物濃度對木霉降解毒死蜱的影響

2.6 pH對木霉降解毒死蜱的影響

研究木霉TC5在pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9五個不同梯度條件對毒死蜱的降解效果，結果如圖5所示。在5個不同pH梯度條件下，接種木霉5 d后，毒死蜱殘留分別降至40.00±1.73 mg/L、23.33±1.85 mg/L、4.03±1.38 mg/L、11.67±1.02 mg/L、16.67±1.15 mg/L，降解率分別為55.98%、74.93%、95.85%、85.02%、70.17%。在中性條件下，木霉對毒死蜱具有最高的降解活性；在酸性條件下，毒死蜱相對穩定，隨著pH5降低，降解活性也降低；而在堿性條件下毒死蜱不穩定，隨著pH升高降解活性也顯著降低，這與腸桿菌（Enterobactor sp.）或芽孢桿菌（B. pumilus）等細菌的降解特性顯著不同［1，12］，即在高pH條件表現較高的降解活性。保護地土壤一般偏酸性，因此毒死蜱在其中穩定性好，在應用生物菌劑處理時，可考慮提高土壤的pH，以利于發揮生物菌的活性。

2.7 土壤中木霉對毒死蜱的降解

在滅菌土和未滅菌土壤中，木霉TC5對毒死蜱的降解差異顯著（圖6）。在滅菌土中，木霉對毒死蜱保持較高的降解率，培養2周后，使用低劑量的木霉菌的處理（A1）和高劑量的木霉處理（A2）毒死蜱殘留降為4.07±0.95 mg/L和2.77±1.12 mg/L，降解率分別達95.8%、97.15%，處理間差異不顯著；而在未滅菌土壤（B組）中，低劑量和高劑量木霉菌處理的毒死蜱殘留分別為27.83±3.73 mg/L和14.60±2.58 mg/L，降解效率顯著低于滅菌土壤中的處理；兩個劑量的處理間降解效率有明顯差異，降解率分別為69.91%和84.22%。該結果表明受土壤中其他微生物影響，木霉對毒死蜱的降解作用明顯受到影響，且低劑量的木霉受影響更大。

圖5 pH對木霉降解毒死蜱活性的影響

圖6 土壤中木霉對毒死蜱的降解

3 討論

從被農藥污染的土壤或農藥廠污泥中分離毒死蜱降解菌，往往獲得1株或2株降解菌，且多是細菌［4］。本研究從保護地土壤中分離能降解毒死蜱的真菌，獲得6個不同木霉菌株，表明該環境中降解木霉資源豐富。用富集培養和直接稀釋平板法等不同的分離方式，分別獲得不同的木霉菌株，表明能降解毒死蜱的木霉有不同的競爭能力，在土壤中有不同的種群密度，在菌株分離過程中，應綜合考慮不同的分離篩選方式。篩選的木霉對毒死蜱具有較強的降解能力，在無外加營養元素、低接種劑量或者針對較高濃度的毒死蜱，均能保持較高的降解能力。盆栽條件下，木霉對毒死蜱的降解活性與在搖瓶純培養條件下的降解活性差別明顯，表明木霉等活體微生物在土壤中易受其他微生物種類的影響而有所下降。

本實驗結果表明木霉是一類很有應用開發潛力的降解菌資源，但在盆栽自然土壤條件下，菌體生長易受其他微生物抑制，而導致對毒死蜱的降解效率降低。因此在實際應用過程中，可以通過適當外加營養，提高接種劑量，調整土壤pH等措施，提高木霉的競爭能力和對毒死蜱的降解活性；同時不斷篩選在土壤中有更好適應性和競爭能力的菌株，以提高木霉的競爭性和對毒死蜱降解活性的穩定性，才有可能研發有實際應用潛力的降解菌劑。

我國設施蔬菜發展迅速，但病蟲害危害也越來越重、農藥殘留污染等已經成為影響蔬菜產業主產去健康發展的突出問題，農藥殘留微生物治理及生物防治技術是必不可少的解決途徑。當前，已報道的降解毒死蜱等有機磷農藥的微生物，主要分離自毒死蜱污染土壤、水體底泥及污水處理廠出口污泥，種類多數是細菌［4］，功能較單一，在農業生產上還沒有得到有效應用。由于木霉種類眾多，通常也會表現較強的生防活性，如分離的6個木霉菌株對立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、終極腐霉（Pythium ultimum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）、尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）及灰霉菌（Botrytis cinerea）等具有多樣化的生防作用機理［13］，因此聯合對土傳植物病害生防活性的篩選，可以挖掘多功能木霉菌資源，研究開發兼具土壤污染修復和生防等功能的多功能生物修復菌劑。

4 結論

從長期施藥的設施菜地土壤中分離能降解毒死蜱的木霉菌，共獲得6株不同種類的木霉菌，對毒死蜱具有高效的降解活性,經鑒定分別為哈茨木霉（T. harzianum）、綠色木霉（T. viride）、康寧木霉（T. koningii）、擬康寧木霉（T. koningiopsis）、長枝木霉（T. longibrachiatum）和短密木霉（T. brevicompactum）。測定木霉TC5菌株在不同條件下的降解特性，結果在搖瓶條件下適當外加營養（碳源），提高接種劑量，調整pH至中性或堿性條件等，均有利于提高木霉對毒死蜱的降解活性；而在盆栽土壤環境中，木霉在自然土中對毒死蜱的降解活性明顯低于滅菌土處理，但仍表現較高的降解能力，顯示出較強實際應用開發潛力。

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（責任編輯 李楠）

Isolation and Characterization of the Chlorpyrifos-degrading Trichoderma Strains from the Vegetable Soil in Greenhouse

ZHANG Guang-zhi ZHANG Xin-jian LI Hong-mei GUO Kai YANG He-tong
（Institute of Ecology，Shandong Academy of Sciences，Shandong Provincial Key Lab for Applied Microbiology，Jinan 250014）

To explore and protect the Trichoderma resources that can degrade chlorpyrifos，six different types of Trichoderma strains with high activity of degrading chlorpyrifos were screened from the long-term organophosphorus pesticide contaminated soil. Analyses of morphological characteristics combined with internal transcribed spacer（ITS）rDNA sequences were used to identify them as T. harzianum，T. viride，T. koningii，T. koningiopsis，T. longibrachiatum，and T. brevicompactum，respectively. T. longibrachiatum TC5 with the highest degradation activity was selected to investigate the characterization of degrading chlorpyrifos under the culture condition including extra carbon source，pesticide concentration，inoculum density and pH. Under neutral or alkaline conditions，the strains TC5 had solid degradation activity to chlorpyrifos. Either adding carbon or increasing the inoculum concentration promoted the degradation rate. Degradation activity gradually increased with the increasing of chlorpyrifos concentration in the range of 50-300 mg/L. In the pot experiment，Trichoderma TC5 remained the high degradation activity to chlorpyrifos，but the degradation activity in the natural soil was significantly lower than in sterilized soil. The Trichoderma strains have great potential application in remedying the pesticide-contaminated soil.

Trichoderma；chlorpyrifos；biodegradation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.030

2015-09-30

山東省科技發展計劃（2014GSF121028，2013GNC11019），國家科技基礎性工作專項（2014FY120900）

張廣志，男，助理研究員，研究方向：農業微生物資源挖掘及應用；E-mail：zhanggzh@sdas.org

楊合同，男，研究員；E-mail：yanght@sdas.org