阻斷Rho/ROCK信號傳導通路對大鼠脊髓損傷的治療效果

孫衛

阻斷Rho/ROCK信號傳導通路對大鼠脊髓損傷的治療效果

孫衛

目的 探究阻斷Rho/ROCK信號傳導通路對大鼠脊髓損傷的治療效果。方法 選取大鼠脊髓損傷動物模型150只，分為假手術組、實驗組和對照組，各50只。假手術組進行椎板切除術；對照組進行脊髓橫斷損傷，并對其腹腔注射生理鹽水；實驗組進行脊髓橫斷手術，給予腹腔注射Fasudil。結果 實驗組的RhoA mRNA明顯降低。同時還能見到部分纖維以及大量的NF陽性纖維穿過脊髓橫斷部位，并沿其尾端伸長。結論 阻斷Rho/ROCK信號傳導通路對軸突再生、傳導功能恢復以及損傷脊髓運動具有顯著的促進作用。

Rho/ROCK信號；脊髓損傷；大鼠

成年哺乳動物的中樞神經系統一旦受到損傷，其軸突不能再生，功能不能恢復[1]。但是周圍的損傷神經可以再生而且功能也能夠恢復。Rho/ROCK信號在軸突再生的信號傳遞中起著重要的中介作用，因此可通過對信號傳導通路中的Rho/ROCK信號進行抑制，進而抑制細胞外生長因子[2-3]。本研究通過阻斷Rho/ROCK信號傳導通路對大鼠脊髓損傷的治療效果進行研究，確定其能否對軸突再生以及功能恢復起到促進作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取大鼠脊髓損傷動物模型150只，隨機分為假手術組、實驗組和對照組。體質量170～210g，采用3%的戊巴比妥鈉（30mg/kg）進行腹腔麻醉，將背部正中處切開，使脊髓T6～T7通過下行椎板切除術暴漏在手術顯微鏡下，再將脊髓完全橫斷，最后將肌肉以及皮膚逐層縫合。

1.2 方法 對假手術組大鼠進行椎板切除術；實驗組對大鼠進行脊髓橫斷手術，給予腹腔注射Fasudil（10mg/kg; ROCK抑制劑；成都苑東藥業有限公司；批準文號H20040117；規格2mL：30mg/瓶）；對照組對大鼠進行脊髓橫斷損傷，并對其腹腔注射生理鹽水。

1.2.1 提取總RNA 在術后4周，分別選取距脊髓橫斷上處、下處的脊髓組織10mm，與少量的液氮進行混合研磨，直至組織變軟，反復加入少量液氮研磨3次。在室溫條件下，以每50～100mg組織加入1mL Trizol[上海聯碩生物科技有限公司；貨號：15596-026（100mL）15596018（200mL）]對其進行配置，放置5min。并采用轉速為12000rpm，離心處理5min。將每毫升的Trizol加入200μL氯仿進行調配，隨后振蕩搖勻，在室溫條件下擱置15min。在溫度為4℃的條件下，使用轉速12000rpm，離心處理15min。將上層的水相吸出，放入另一離心管。將每毫升的Trizol加入異丙醇0.5mL，混合搖勻，在室溫下，擱置5～10min。在溫度為4℃的條件下，使用轉速12000rpm，離心處理10min，將上清吸出，管底則為RNA。將每毫升的Trizol加入75%的乙醇1mL，震蕩離心管，使其沉淀懸浮。在溫度為4℃的條件下，使用轉速8000rpm，進行離心處理5min，將上清吸出，室溫條件下，實行晾干或者干燥處理5～10min。在55～60℃條件下，使用焦炭酸二乙酯（上海翊圣生物科技有限公司；產品貨號：10602ES25；規格：25mL）50μL進行處理，并采用高壓純水RNA溶解，將樣品擱置5～10min。

1.2.2 逆轉錄PCR 選取1μL0.2mL的總RNA置于離心管，并放入冰浴，加入1μL的RT/Taq MIX、2倍25μL反應緩沖液和各1μL的特異上下游引物[2]。通過加入DEPC—ddH2O直至體積變為50μL，采用輕柔振蕩將其混勻。讓其在40℃的條件下反應30min，在94℃下進行2min保溫處理，將其溫度及時間由94℃15s變為60℃30s，反復40次，放置在72℃下10min。提取5μLPCR產物和瓊脂糖凝膠電泳2%，進行凝膠成像處理，根據RhoA和β-actin的灰度比值，確定RhoA mRNA的相對水平。

1.2.3 HE染色和NF免疫熒光染色 手術4周后，對剩余實驗大鼠的心臟采用4%多聚甲醛以及4℃生理鹽水進行灌注固定，分別選取距脊髓橫斷上處、下處的脊髓組織10mm，放入20%的蔗糖溶液，在4℃條件下，進行過夜保存。使用常規石蠟對脊髓組織進行包埋，將矢狀位和橫斷位組織進行連續切片，將厚度保證在10μm，對切片進行染色[3]。

將石蠟切片進行水化和脫蠟處理，并加入3%的H2O2甲醇溶液，在室溫下孵育10min。每次使用0.01MPBS對其進行清洗5min，反復3次，加入封閉血清在室溫下封閉放置20min，將封閉液吸出，加入50倍稀釋的相應一抗，在4℃下孵育過夜，使用PBS反復清洗3次，每次5min，加入相應二抗，室溫下孵育30min，最后再使用PBS反復清洗3次，每次5min，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.3 統計學方法 用SPSS19.0統計軟件對數據進行分析，計量資料采用“”表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RhoA mRNA的表達對比 將β-actin作為內參對照，通過β-actin和RhoA mRNA的灰度比值，反應RhoA mRNA的相對水平。各組時間點與對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組Rho mRNA表達數據對比（x±s）

2.2 HE染色比較 假手術組為正常組織，對照組脊髓組織出現水腫，而且結構紊亂，殘留的神經元相對較少，有顯著的細胞浸潤現象，伴隨大量膠質細胞滋生。實驗組相對于對照組較輕，殘留的神經元相對較多。

2.3 NF免疫熒光染色比較 假手術組的脊髓組織軸突分布正常。對照組的NF排列雜亂，密度較低，而且在空洞區未發現NF陽性纖維進入。實驗組NF排列雜亂，密度較高，在空洞區有部分纖維穿過橫斷脊髓，并沿其尾端伸長。

3 討論

成年哺乳動物脊髓損傷，其軸突很難再生。主要原因是由于在局部環境存在一直軸突再生的抑制因子[4-5]。抑制因子可通過信號傳導通路，對軸突再生進行有效抑制。小分子GTP酶Rho能夠與很多分子相互作用，成為信號蛋白，具有調整神經元形成的作用[6]。當Rho酶與GTP結合后，成為Rho激酶的直接活化因子，能夠和ROCK結合。激活后的ROCK可將肌球蛋白等多種靶蛋白輕鏈磷酸化，進而可以使神經元細胞骨架重新排列[7-8]。因此，Rho激酶是信號傳導通路的重要成分。Fasudil是Rho激酶的抑制劑，作用機制是通過和ATP競爭Rho激酶催化區的結合位點，進而有效的抑制了Rho激酶的活性，阻斷了信號的傳遞[9]。

本研究通過阻斷Rho/ROCK信號傳導通路對大鼠脊髓損傷的治療效果進行研究,研究結果表明，實驗組的RhoA mRNA明顯降低。同時還能見到部分纖維以及大量的NF陽性纖維穿過脊髓橫斷部位，并沿其尾端伸長。

綜上所述，阻斷Rho/ROCK信號傳導通路對軸突再生、傳導功能恢復以及損傷脊髓運動具有顯著的促進作用。

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[9] 郝珍,冷玉芳,金建萍,等.青藤堿對神經病理性痛大鼠脊髓背角神經元凋亡的影響[J].中華麻醉學雜志,2014,34(2):178-182.

Objective To explore the therapeutic effect of blocking Rho/ROCK signal transduction pathway on spinal cord injury in rats. Methods 150 rats were divided into sham operation group, experimental group and control group, 50 rats in each group. The sham operation group was the control group laminectomy; spinal cord injury, and the intraperitoneal injection of normal saline; the experimental group was given intraperitoneal injection of spinal cord transection surgery, Fasudil. Results mRNA RhoA in the experimental group was significantly decreased. At the same time also can see the part of the fiber and a large number of NF positive fibers through the spinal cord transection site, and along its tail elongation. Conclusion Blocking the Rho/ ROCK signal transduction pathway has a significant role in promoting axonal regeneration, functional recovery and spinal cord injury.

Rho/ROCK signal; Spinal cord injury; Rat

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.29.001

江西 330006 江西省人民醫院神經外科 （孫衛）