快速高分辨率液相色譜-串聯質譜法測定牛肉中24種鎮靜劑類獸藥殘留量

魏晉梅，周圍，解迎雙，張麗，方素櫟，羅玉柱*，張詠梅

1(甘肅農業大學研究測試中心，甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州, 730070)　2(甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州,730020) 3(甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州,730070)　4(甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州,730070)

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快速高分辨率液相色譜-串聯質譜法測定牛肉中24種鎮靜劑類獸藥殘留量

魏晉梅1，周圍2，解迎雙2，張麗3，方素櫟4，羅玉柱1*，張詠梅1

1(甘肅農業大學研究測試中心，甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州, 730070)2(甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州,730020) 3(甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州,730070)4(甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州,730070)

摘要建立了牛肉中 24 種鎮靜劑類藥物殘留量的檢測方法。樣品經氨水-乙腈溶液(體積比10∶90)和 30 μL β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶提取后，用HLB 固相萃取小柱凈化，采用快速高分辨率液相色譜-串聯質譜(RRLC-MS/MS)檢測，以信噪比(S/N)分別為3和10時測定藥物的檢出限(LODs)和定量限(LOQs)。各藥物在添加濃度水平范圍均有良好的線性關系，相關系數(r2)在 0.963 9～0.999 8之間，LODs 為 0.2～2.5 μg/kg，LOQs 為0.5～5 μg/kg，平均添加回收率為 74.1%～123.9%，日內相對標準偏差(RSD)為2.6～9.9%，日間相對標準偏差(RSD)為2.9～9.9%。該方法靈敏度高、回收率高，為鎮靜劑類藥物殘留量檢測提供了基礎方法，可滿足同類實驗室的檢測需求。

關鍵詞鎮靜劑；高分辨率液相色譜-串聯質譜；牛肉

鎮靜劑是臨床常用的能使動物中樞神經系統產生輕度抑制、減弱機能活動，起到消除躁動不安、恢復安靜的一類藥物，常被不法分子作為生長促進劑用于動物養殖中，從而對公眾健康造成一定的危害。許多國家都將此類藥物列為禁用藥物。我國農業部 176 號[1]和235 號[2]公告規定嚴禁在動物飼料和飲用水中使用此類藥物，在動物源食品中不得檢出此類藥物。

目前，國內外報道的鎮靜劑類藥物及其代謝物的檢測方法有氣相色譜法(GC)[3]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[4-5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、液相色譜-質譜聯用法(LC-MS)[7]、液相色譜-串聯質譜聯用法(LC-MS/MS)[8-11]等。涉及的樣品主要有豬肉、豬腎、豬肝、保健品和水產品等。嚴麗娟等[12]建立了超高效液相色譜-飛行時間質譜法高通量篩查乳制品中 20 種鎮靜劑的方法，吳寧鵬等[13]采用超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜法篩查飼料中 11 種鎮靜劑類藥。外源性化合物在畜牧業中的使用已經引起了消費者的焦慮與恐慌，食品安全已經成為全世界關注的焦點之一。因此，深入研究獸藥殘留檢測方法是保證我國食品質量安全的迫切需要。

本文建立了牛肉中24 種鎮靜劑類藥物殘留量的快速高分辨率液相色譜-串聯質譜(RRLC-MS/MS)檢測方法，該方法靈敏度高、回收率高，可為鎮靜劑類藥物的殘留檢測提供科學參考依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

牛肉樣品：購自桃海市場(蘭州)。

對照品：唑吡坦(171258-200601，100%)、氟哌啶醇(100313-200301，100%)、氯氮卓(171248-200301，100%)、氯丙嗪(100460-200501，100%)、奮乃靜(100133-200602，100%)、氟奮乃靜(100162-201003，≥ 98.8%)、奧沙西泮(171229-201104，100%)、艾司唑侖(171219-201003，≥ 99.7%)、阿普唑侖(171218-201104，≥ 99.1%)、三唑侖(171230-201203，≥ 99.6%)、地西泮(171225-201304，≥ 99.9%)、咪達唑侖(171265-201001，≥ 99.8%)、氯硝西泮(171227-201103，100%)、硝西泮(171217-200402，100%)、異丙嗪(100422-201002，≥ 99.4%)等購自中國藥品生物制品檢定所；甲苯噻嗪(11010，≥ 98.0%)、丙酰丙嗪(10404，≥ 99.0%)、咔唑心安(00421，≥ 99.0%)、阿扎哌隆(20124 ，≥ 98.5%)、乙酰丙嗪(20010，≥ 99.0%)，購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司 (德國)；氟哌利多(CDCU-1229001)為 USP標準品；安眠酮(Y000701)為歐洲藥典對照品，去甲地西泮(FE110410-01，1.0 mg/mL甲醇溶液)和替馬西冸Temazepam (FE012111-06，1.0 mg/mL甲醇溶液)購自Cerilliant公司(美國)；巴比妥酸(WXBB2078，≥99.0%)購自Sigma-Aldrich公司(德國)。

試劑：甲醇和乙腈為色譜純試劑，購自Merck 公司(德國)；β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶購自Sigma-Aldrich公司(德國)；其他試劑均為國產分析純試劑。

超快速液相色譜串聯質譜儀(RRLC-MS/MS)：Agilent 1290 series液相色譜儀，配有G1322A 脫氣系統，G1312B SL二元泵，G1357D 高精確度自動進樣器(HiP ALS SL+)；Agilent 6460四級桿串聯質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI，G1948B)(Agilent Technologies，美國)。AB104-N 電子天平(Mettler Toledo 公司，瑞士)；RE-52C 旋轉蒸發儀( 鄭州市亞榮儀器有限公司)；SUPRA 22K 高速離心機( Hanil 公司，韓國)；KH3200B 型超聲波清洗器 (昆山禾創超聲儀器有限公司)；Milli-Q超純水系統(Millipore公司，美國)；Oasis HLB (6 mL，200 mg)固相萃取小柱(Waters 公司，美國)。

1.2實驗方法

1.2.1標準貯備液和工作溶液的制備

分別稱取 24 種對照品 和內標物質5 mg，用甲醇溶解，并定容至 25 mL 的容量瓶中，此貯備液濃度均為 200 μg/mL；混合標準中間工作溶液用0.027 mol/L甲酸-乙腈溶液稀釋貯備液而得，濃度為 50、30、10、5、2、1 和 0.5 μg/L，此工作液中均含有20μg/L巴比妥酸；基質匹配標準工作溶液為空白牛肉樣品的提取液。所有的標準溶液于棕色瓶中置于-18 ℃保存。

1.2.2樣品制備

牛肉樣品絞碎、混合、均質，置于-18 °C 保存，以備后用。分析之前，從冰箱中拿出均質好的樣品，解凍至室溫。準確稱取 5 g 樣品于聚丙烯離心管中(50 mL)，加入 1 mL 20μg/L內標、15 mL 0.26 mol/L氨水-乙腈溶液(體積比10∶90)和 30 μL β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，置于黑暗中 37 ℃渦旋振蕩 10 h，30 ℃超聲提取 10 min后，2 810×g 離心 5 min，移取上清液于聚丙烯離心管中(50 mL)，殘渣中加入15 mL 0.26 mol/L的氨水-乙腈溶液(體積比10∶90)，30 ℃超聲提取 10 min，重復此步驟2次，合并上清液。上清液中加入 5 g NaCl 和 5 mL 正己烷，渦旋混合，靜置10 min，棄去上層液體(正己烷層)，過濾。濾液于 37 °C 減壓旋轉蒸發至近干，殘渣用 3 mL 甲醇溶解。

HLB固相萃取小柱分別用 5 mL 甲醇活化、5 mL 水平衡，保持柱體濕潤。將上述甲醇溶液加入 HLB 小柱中，用5 mL 水淋洗小柱，抽干，5 mL 乙腈洗脫，洗脫液于37 ℃減壓旋轉蒸發至近干，殘渣用1 mL 0.027 mol/L甲酸-乙腈(體積比90∶10)溶解，過0.22 μm 水相濾膜，供 RRLC-MS/MS測定。

1.2.3RRLC-MS/MS分析

液相色譜分離條件：Acquity UPLC CSHTMC18色譜柱 (100 mm × 2.1 mm i.d.，粒徑 1.7 μm，Waters 公司，美國)；柱溫 30 °C；流動相為乙腈(A)和 0.027 mol/L甲酸溶液( B )，梯度洗脫程序為 10% A → 70% A (1～15 min)→ 10% A (15～16 min)，流速 0.3 mL/min， 進樣量 5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描、多反應監測(MRM)模式；毛細管電壓 +3.2 kV；錐孔電壓 +1 kV；離子源溫度 120 ℃；脫溶劑溫度 350 ℃；噴霧氣為氮氣(0.31 MPa)；載氣流速 10 L/min，溫度 350 ℃；鞘氣流速 11 L/min，溫度 350 ℃；脫溶劑氣流速 500 L/h；錐孔反吹氣流速 50 L/h；質量掃描范圍 m/z 80～1 000；掃描時間 0.05 ms。每種藥物優化后的錐孔電壓、毛細管電壓、定性離子和定量離子等參數見表 1。Agilent Mass Hunter 工作站(Agilent Technologies，美國)用于控制儀器、數據采集和結果分析。

1.2.4方法驗證

本研究在實驗室內進行分析方法的驗證。在空白牛肉的提取液中加入系列混合標準工作溶液，經 RRLC-MS/MS 測定，以藥物的峰面積為縱坐標 y，以添加濃度為橫坐標 x 建立各藥物的線性回歸方程，并以信噪比(S/N)分別為 3 和 10 確定方法的定性限(LOD)和定量限(LOQ)。基質匹配溶液中的混合標準工作溶液的濃度為：

(1)阿扎哌隆、甲苯噻嗪、咔唑心安、氯丙嗪、氯氮卓、丙酰丙嗪和氟哌丁醇：5、10、20、30、 50 μg/kg。

(2)硝西泮、唑吡坦、乙酰丙嗪、氟哌利多和氟奮乃靜：0.5、1、10、30、50 μg/kg。

(3)奮乃靜、異丙嗪：1、5、10、30 、50 μg/kg。

(4)氯硝西泮：2、10、20、30 、50 μg/kg。

(5)三唑侖、替馬西冸、地西泮、阿普唑侖、艾司唑侖和奧沙西冸：5、10、25、50、100 μg/kg。

(6)安眠酮、咪達唑侖和去甲地西泮：10、25、50、100、200 μg/kg。

表1　優化后的質譜參數

方法的準確度和精密度通過測定日內和日間加標回收率評價，加標濃度為1、5 和 10 μg/kg。日內分析時，每個濃度水平重復測定 6 次；日間分析時，每個濃度水平重復測定 3 次，連續測定3 d。

2結果與分析

2.1樣品制備

24種鎮靜劑具有不同的化學結構和性質，對不同溶劑的溶解性也不同，為了有效地同時從牛肉樣品中提取 24 種鎮靜劑類獸藥，本實驗嘗試了分別用乙腈、甲醇、乙酸乙酯、氨水-二氯甲烷(體積比5∶95)、氨水-乙酸乙酯(體積比5∶95)、氨水-乙腈(體積比10∶90)、氨水-甲醇(體積比10∶90)、甲醇-乙酸乙酯(體積比1∶1)、0.1 mol/L HCl-乙腈(體積比5∶95)、以及水與甲醇或乙腈組成的不同配比的溶液等試劑對樣品進行提取。實驗發現，堿性試劑的提取溶液中藥物的回收率高于其他試劑，其中氨水-乙腈(體積比10∶90)的提取液中藥物的回收率較其他溶液的回收率高，但各藥物的回收率仍低于 65%。提取液中加入 30 μL β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶進行提取時，各藥物的回收率可達到 80%以上，說明弱堿性條件和酶解作用有利于樣品中鎮靜劑類藥物的溶出。這可能是有些藥物的化學結構中含有氨基或(和)羥基，這些基團可與葡糖醛酸、芳基硫酸糖苷或動物代謝過程中形成的酯結合，從而從肉樣品中析出至提取液中，因此回收率得到了提高[8]。

用活化并平衡好的固相萃取小柱 Oasis HLB對提取液進行凈化，結果表明Oasis HLB小柱能有效地去除檢測中的干擾雜質，因此，實驗選擇Oasis HLB 固相萃取小柱為凈化柱。

2.2MRM離子選擇

檢測獸藥殘留時，歐盟委員會規定(Commission Decision 2002/657/EC)[14]至少有 4 個識別點才能對藥物進行確證。RRLC-MS/MS 檢測中，母離子和子離子分別可獲得 2 個和 2.5 個識別點。阿扎哌隆、甲苯噻嗪和氯硝西泮分別獲得4.5識別點，阿普唑侖有1個母離子和3個子離子，可獲得 9.5 個識別點，其他藥物均獲得7個識別點。因此，所有的分析物可以在 MRM 監測模式和 ESI+掃描模式下進行確證和測定。24 種藥物和內標化合物的MRM 色譜圖見圖 1。

2.4方法驗證

2.4.1線性關系與檢出限

被分析物的色譜峰峰型對稱、沒有干擾因素時，根據保留時間和質量檢測可以對被分析物進行定性，根據 MRM 色譜峰面積定量。本實驗以信噪比(S/N)分別為 3 和 10 時測定各藥物的 LODs 和 LOQs。各藥物的 LODs 在 0.2～2.5 μg/kg，LOQs 在 0.5～5 μg/kg。在基質匹配工作溶液中添加系列混合標準工作液進 RRLC-MS/MS 分析測定，以化合物的定量離子色譜峰面積(經內標校正)為縱坐標，化合物添加濃度為橫坐標進行線性回歸，得到標準曲線方程。24 種鎮靜劑類獸藥在添加濃度水平范圍均勻良好的線性關系，相關系數(r2)在 0.963 9～0.999 8之間(表 2)。

圖1　空白牛肉中添加 24 種鎮靜劑類獸藥和內標物質的 MRM 色譜圖Fig. 1　MRM chromatograms of a blank mutton spiked with 24 sedatives and internal standard

表2　24種藥物的標準曲線、相關系數、定性限和定量限

2.4.2方法的準確度和精確度

在空白牛肉樣品中，添加1、5和10 μg/kg 3個水平標準工作溶液，進行提取回收實驗，以評價方法的準確度和精密度。日內分析時，每個添加濃度水平進行6個重復測定，日間分析時，每個添加濃度水平進行3個重復測定，連續3 d重復測定。24種鎮靜劑藥物在空白牛肉中的平均添加回收率為 74.1%～ 123.9%日內相對標準偏差(RSD)為2.6%～ 9.9%，日間相對標準偏差(RSD)為 2.9%～ 9.9% (表 3)，日內、日間相對標準偏差均小于 10%，回收率和相對標準偏差均符合國內外相關標準和法規的要求。方法有足夠的靈敏度，可用于檢測實際樣品。

表3　24種鎮靜劑類藥物的回收率實驗結果

3結論

建立了RRLC-MS/MS 測定牛肉中24 種鎮靜劑類藥物殘留量的方法。在信噪比(S/N)分別為 3 和 10 時各藥物的 LODs 在 0.2～2.5 μg/kg、LOQs 在 0.5～5 μg/kg。24種鎮靜劑藥物在空白牛肉中的平均添加回收率為 74.1%～ 123.9%日內相對標準偏差(RSD)為2.6%～ 9.9%，日間相對標準偏差(RSD)為 2.9%～ 9.9%，日內、日間相對標準偏差均小于 10%，回收率和相對標準偏差均符合國內外相關標準和法規的要求。RRLC -MS/MS能夠為牛肉樣品的分析提供足夠的分析靈敏度和精度。該方法回收率高、精密度好，能夠滿足獸藥殘留分析的要求。

參考文獻

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Determination of 24 sedative residues in beef by rapid resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry

WEI Jin-mei1, ZHOU Wei2, XIE Ying-shuang2, ZHANG Li3,FANG Su-li4, LUO Yu-zhu1*, ZHANG Yong-mei1

1( Instrumental Research and Analysis Center, Gansu Agricultural University, Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology, Lanzhou 730070, China) 2( Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou, 730020, China) 3(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China) 4( College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070, China)

ABSTRACTA rapid resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry (RRLC-MS/MS) method was established for the determination of 24 sedatives residues in beef. After enzymolysis, sedatives residues in beef were extracted by ammonium hydroxide-acetonitrile (10∶90, v/v) and determined by RRLC-MS/MS and quantified by standard curve . The calibration curves showed good linearity within the concentrations of spiked levels with the correlation coefficients (r2) ranged from 0.9639 to 0.999 8. The limits of detection (LODs) and quantification (LOQs) were 0.2～2.5 and 0.5～5 μg kg(-1), respectively. The average recoveries of spikes samples were in the ranges of 74.1 ～ 123.9% with relative standard deviations of intra- and inter-day ranged from 2.6% to 9.9% and from 2.9% to 9.9%, respectively. This method is simple, sensitive and accurate in the determination of sedative residues.

Key wordssedatives; rapid resolution liquid chromatography-tandem mass spectrometry (RRLC-MS/MS); beef

收稿日期：2015-05-13，改回日期：2015-09-06

基金項目：甘肅省自然科學基金項目(1208RJZA156)；甘肅省自然科學基金重點項目(1010RJZA202)；甘肅省財政廳項目(基于指紋圖譜技術的牦牛產地鑒別與新鮮度評價研究)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602033

第一作者：博士，副研究員(羅玉柱教授為通訊作者,E-mail:yuzhuluo@yeah.net)。