利用控pH流加培養法提高雨生紅球藻的生物量及蝦青素產量

王旎，管斌，孔青，孫翰，耿兆艷，段良飛

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)

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利用控pH流加培養法提高雨生紅球藻的生物量及蝦青素產量

王旎，管斌*，孔青，孫翰，耿兆艷，段良飛

(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)

摘要研究了一種新型培養方法——控pH流加培養法，可有效促進雨生紅球藻生長并提高蝦青素產量。測定雨生紅球藻生長期間對營養鹽的需求量，依據對數生長期藻液pH與硝酸鹽和磷酸鹽的含量的線性關系，確定流加液組成及流加方法。流加液的組成為7.88 g/L的 KNO3，1.83 g/L的KH2PO4和24.0 g/L 的CH3COONa，監測對數生長期藻液pH變化情況，通過添加流加液將藻液的pH值持續控制在7.5～8.0內，雨生紅球藻的細胞干重可達(1.42 ± 0.04) g/L，蝦青素產量可達(60.23 ± 1.81) mg/L。

關鍵詞雨生紅球藻；蝦青素；pH；流加培養

蝦青素(astaxanthin)化學名稱為3,3'-二羥基-4,4'-二酮基-β,β'-胡蘿卜素，分子式為C10H52O4，含多個共軛雙鍵[1]，具有極強的抗氧化作用，可有效清除自由基[2]，有抗腫瘤、增強免疫力和改善視力等多種生理功效[3]。蝦青素是優質的天然色素，在食品、化妝品、飼料等生產領域均有應用[4]。蝦青素可以化學方法合成[5]或者由甲殼類動物體內提取[6]，也可利用真菌[7]及微藻[8]生產。雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是最豐富的天然蝦青素來源之一[9]，蝦青素含量占干重的1.5 %～5.0 %[10]，被譽為天然蝦青素的“濃縮品”[11]。

提高雨生紅球藻的生物量是提高蝦青素產量的關鍵，現有的培養方法包括一步法[12]、生長轉化兩步法[13]、固定膜培養法[14]以及流加動力學模型[15]等。流加培養是一種非常有效的提高雨生紅球藻生物量的方法，采用不同的培養周期，在培養9 d后生物量能達1.0 g/L以上[15]，培養20 d后達2.0 g/L以上[16]。目前，大規模培養雨生紅球藻來生產蝦青素仍存在一些技術難點，工業生產中雨生紅球藻的含量僅在0.2～0.5 g/L[17]，繼而使得蝦青素生產能力遠遠低于市場需求量。流加技術成為雨生紅球藻工業應用中的迫切需求，然而流加過程中存在的一系列困難大大限制了它的應用，包括流加時間、流加量以及流加液中各營養成分比例的確定。本論文采用連續流加進行培養，測定雨生紅球藻生長階段對營養鹽的消耗情況，依據對數生長期藻液pH值與營養鹽含量的線性關系，確定流加液組成及流加方法，以期提高雨生紅球藻的生物量與蝦青素的產量。

1材料與方法

1.1藻種與培養基

實驗藻種為本實驗室保藏的雨生紅球藻712株，培養時采用改良的MCM培養基[18]。

1.2雨生紅球藻的生長與轉化條件

將已活化的藻種接種到適量培養基中，接種量為10 %，采用白天：黑夜為12 h∶12 h的光照周期，光照強度2 500 lx，培養溫度22℃，于恒溫箱中培養9 d。自第10天起將雨生紅球藻轉入營養鹽脅迫環境下使之開始積累蝦青素，全天光照，光照強度7 500 lx，培養溫度30 ℃，于恒溫箱中繼續培養10 d。

1.3雨生紅球藻的控pH值流加培養

生長第4天的雨生紅球藻進入控制pH的流加培養階段。持續監測藻液的pH值，若其超出7.5～8.0的范圍，則向藻液中添加適量的流加液，使之穩定保持在此范圍內。

1.4藻細胞干重和生長速率的測定

取適量藻液，使用分光光度計分別測定波長680 nm和750 nm下藻液的吸光度[19]。

細胞干重(N)/(g·L-1)=[-4.2 × {(OD680-OD750)/OD680} + 1.4] × OD680

生長速率μ= (lnNt-lnN0) /t，其中Nt表示培養時間為t時的細胞干重(g/L)，N0表示初始細胞干重(g/L)。

1.5蝦青素含量的測定

取適量的藻液，離心，除上清液。在沉淀物中等體積加入甲醇-KOH溶液(30 %甲醇與5% KOH溶液等體積混合)，振蕩混勻。將藻懸液于65℃中水浴20 min，離心，洗滌。沉淀中加入二甲基亞砜與丙酮混合液(體積比為4∶1)，200 W超聲波破碎細胞10 min，40℃中水浴振蕩20 min，離心，收集上清液。重復提取直至藻體顏色發白，混合多次提取的上清液，于490 nm波長下測吸光度[20]。上述步驟均在避光條件下操作。

蝦青素含量(C)/(mg·L-1)=4.5 ×OD490×(Va/Vb)× f

其中：Va，二甲基亞砜-丙酮提取液的總體積，mL；Vb，所取藻液的體積，mL；f，表示測定吸光度時溶液的稀釋倍數。

2結果與討論

2.1乙酸鈉濃度對雨生紅球藻生長的影響

含不同初始濃度乙酸鈉的培養基對于雨生紅球藻細胞生長的影響如圖1所示。從圖1可看出，培養基中乙酸鈉的初始濃度對于雨生紅球藻細胞生長的影響較大，當乙酸鈉濃度為2.4 g/L時，藻的生長狀況最佳，生長速率最大，其細胞干重可達(0.78 ± 0.03) g/L。與未添加乙酸鈉的培養結果相比，含乙酸鈉培養基中雨生紅球藻的細胞干重和生長速率均有大幅度提升，這是由于雨生紅球藻可利用乙酸鈉進行混合營養生長[21]，在缺乏光照的夜間環境里也可以積累生物量。因此，本實驗中選用2.4 g/L的乙酸鈉作為培養基的碳源。

圖1　乙酸鈉濃度對雨生紅球藻生長的影響Fig.1　Effect of sodium acetate concentration on growth of Haematococcus pluvialis

2.2流加液組分及流加方法的確定

將乙酸鈉作為碳源，其培養基初始濃度為2.4 g/L，測定生長期間藻液的硝酸鹽含量、磷酸鹽含量與pH值(見圖2)。由于藻細胞在生長期間造成營養鹽的消耗，藻液中的營養鹽含量及pH值會發生相應的變化。從圖2可看出，隨著藻細胞增殖而不斷消耗氮磷營養物，培養液中的硝酸鹽和磷酸鹽濃度呈下降趨勢，pH值呈升高趨勢。從生長的第2天開始，細胞干重增加的速率快速增加，氮磷營養鹽的濃度明顯降低，表明雨生紅球藻的生長進入對數期，藻細胞快速生長，對營養鹽的消耗量增大。而在第7天后，營養鹽的消耗速率和pH值的升高都開始放緩，并伴隨有周期性波動，這是由于營養的消耗使一定的培養環境所能容納的細胞數量接近上限，營養鹽的供給不能滿足藻細胞生長的需求，細胞開始調節自身代謝來重新適應環境，細胞生長活力降低，宏觀表現為細胞群體向培養液中釋放的氮磷鹽大于吸收量。從圖2還可看出，波動可能是由于細胞在無光照時間段內的死亡率上升，這說明培養液中的碳源也不能滿足藻細胞的需求。

圖2　雨生紅球藻生長期間營養鹽及pH的變化Fig.2　Changes of pH, concentration of nitrate and concentration of phosphate in cultivation process of Haematococcus pluvialis

此外，由圖2可見，培養過程中營養鹽濃度的變化與pH值的變化步調剛好相反，可推測兩者之間存在的相關性。將藻液pH分別與硝酸鹽濃度、磷酸鹽濃度進行線性擬合，如圖3所示，研究發現，對數生長期藻液的pH值與硝酸鹽、磷酸鹽的濃度分別呈一定的線性關系。藻液pH值與硝酸鹽濃度(mg/L)的一次函數關系為y=-80.86x + 950.17，R2= 0.96；藻液pH值與磷酸鹽濃度(mg/L)的一次函數關系y=-18.56x + 189.46，R2= 0.98。因此，藻液中營養鹽的含量可以由一個簡單易測的指標pH來反映，即測得藻液的pH值，便可計算出硝酸鹽、磷酸鹽的消耗量，進而可得知藻細胞的生長狀況。

根據雨生紅球藻細胞的生長情況與碳、氮、磷營養物質的消耗情況，考慮進入對數生長期后采用流加營養鹽的方法補充細胞所需物質，可改善藻細胞的生長狀態。然而，何時流加與流加量的確定是流加培養的關鍵，既要滿足藻細胞的吸收量，又要防止某一時段內培養液中過高的氮磷濃度抑制藻細胞生長[22]。結合圖2、圖3，根據雨生紅球藻細胞在不同生長階段對營養物質的需求量，以及營養鹽的濃度與pH之間存在的特定關系，探究出一種新型的便捷有效的雨生紅球藻培養方法——控pH流加培養法，跟蹤測定藻液的pH值，適時向藻液中添加流加液，使pH值保持在一定的范圍內。這既保證了營養鹽的適量補充，滿足藻細胞生長所需的適宜pH范圍，又將流加時間與流加量用易于監測和控制的指標pH值來指示，具有可操作性。

圖3　對數生長期營養鹽含量與pH間的關系Fig.3　Relationship among pH, concentration of nitrate and concentration of phosphate in logarithmic phase

流加液中硝酸鹽及磷酸鹽的含量根據雨生紅球藻生長期間的消耗量來確定，乙酸鈉濃度取初始培養基濃度的10倍[23]。由圖2可得雨生紅球藻對KNO3和KH2PO4的總消耗量，根據培養天數可計算日平均消耗量。由圖3可得KNO3和KH2PO4的消耗量之比為4.36∶1。實驗中根據雨生紅球藻的生長情況，對流加液的組成進行一定的優化調整，最終確定流加液的組成為24.0 g/L 的CH3COONa，7.88 g/L的 KNO3和1.83 g/L的KH2PO4。此外，補料從雨生紅球藻細胞生長第4天開始進行，防止生長前期產生營養鹽的高濃度抑制作用。

2.3pH對雨生紅球藻生長的影響

為測定雨生紅球藻的最適生長pH范圍，生長過程中用HCl調節藻液pH，使培養液的pH值始終維持在一定范圍內。在該種條件下，pH對其生長的影響如圖4所示。從圖4可看出，pH為7.5～8.0的偏堿性環境中雨生紅球藻的生長速率最大，細胞干重達(0.91 ± 0.02) g/L，因此確定流加時需將藻液pH值控制在7.5～8.0的范圍內。

圖4　pH對雨生紅球藻生長的影響Fig.4　Effect of types of pH on the growth of Haematococcus pluvialis

2.4控pH流加培養的效果

通過監測pH的變化進行適時適量補料，添加流加液使得藻液的pH維持在最適pH值在7.5～8.0內，既調節了雨生紅球藻生長環境的pH，也合理補充了生長所需的營養物質(如圖5所示)。從圖5可看出，采用控pH流加培養的方法后，雨生紅球藻的細胞干重大幅增加，較未流加培養的藻細胞干重提高了1倍多，達到(1.42 ± 0.04) g/L。同時，流加培養后雨生紅球藻細胞對數生長期延長，生長速率明顯提高。將轉化完全的雨生紅球藻取出，測定其蝦青素產量(如圖6所示)。從圖6可看出，流加培養組的產量為(60.23 ± 1.81) mg/L，比未流加培養組提高了近1倍。可見，控pH流加培養方法的應用可以很大程度上提高雨生紅球藻生物量及產蝦青素。

圖5　流加培養對雨生紅球藻細胞干重的影響Fig.5　Effect of fed-batch culture on dry cell weight of Haematococcus pluvialis

圖6　流加培養對雨生紅球藻產蝦青素的影響Fig.6　Effect of fed-batch culture on production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis

3結論

本研究揭示了雨生紅球藻生長過程中pH與營養鹽消耗的線性關系，從而創新地提出了控pH流加培養方法。控pH流加培養法是一種針對性強、效果顯著、理論依據強、可操作性大的新培養方法，為雨生紅球藻提供了適宜需求、持續更新的生長環境，提高了生物量及蝦青素產量。此外，該方法的最大優勢在于將繁瑣的營養鹽消耗特征用易獲取的pH值來表征，這對于規模化生產蝦青素有重要的實際意義。目前，該方法的研究尚處于起步階段，若能進一步完善并運用于工業化生產，定將給雨生紅球藻產蝦青素創造可觀的應用前景。

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Enhancing biomass ofHaematococcuspluvialisand astaxanthin production by pH-controlled fed-batch culture

WANG Ni, GUAN Bin*, KONG Qing, Sun Han, GENG Zhao-yan, DUAN Liang-fei

(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

ABSTRACTIn this research, a new method of pH-controlled fed-batch culture was utilized to enhance dry cell weight of Haematococcus pluvialis and production of astaxanthin. Conditions of nutrient consumption of Haematococcus pluvialis were measured. The composition of fed-batch media and the details of fed-batch were determined based on the linear relationships between pH and consumption of nutrients of Haematococcus pluvialis in its logarithmic phase. The fed-batch media were consisted of 7.88 g/L nitrate, 1.83 g/L phosphate and 24.0 g/L sodium acetate. By monitoring and controlling pH of the suspension to the range of 7.5～8.0 with the fed-batch media in its logarithmic phase, the dry cell weight of Haematococcus pluvialis was enhanced to (1.42 ± 0.04) g/L, with the production of astaxanthin reaching (60.23 ± 1.81) mg/L.

Key wordsHaematococcus pluvialis; astaxanthin; pH; fed-batch culture

收稿日期：2015-05-23，改回日期：2015-09-07

基金項目：國家“十二五”農村領域科技計劃項目(2013BAD10B02-06)；山東省科技發展計劃項目(2014GSF121029)；國家自然科學基金資助項目(31471657)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602021

第一作者：碩士研究生(管斌教授為通訊作者，E-mail:guanbin@ouc.edu.cn)。