溫度對四川泡菜中菌系及其代謝產物分布的影響

熊濤, 肖陽生, 李軍波, 彭飛, 黃濤

(南昌大學 生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌,330047)

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溫度對四川泡菜中菌系及其代謝產物分布的影響

熊濤*, 肖陽生, 李軍波, 彭飛, 黃濤

(南昌大學 生命科學與食品工程學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌,330047)

摘要以市售圓白菜為原料，按照傳統四川泡菜制作工藝，并分別控制在18、28、37 ℃下恒溫發酵，監測發酵過程中鹵水的pH、微生物(乳酸菌、酵母菌、大腸桿菌)、糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)、有機酸(乳酸和乙酸)、乙醇含量的變化。結果表明：溫度對傳統四川泡菜發酵過程中的菌系結構和代謝有顯著影響。溫度越高，乳酸菌繁殖代謝越快，鹵水pH值下降也越快；低溫發酵泡菜中酵母菌和大腸桿菌存活時間最長，發酵周期也最長；28 ℃恒溫發酵時大腸桿菌消亡最快，發酵結束時果糖和乙醇含量最低；37 ℃恒溫發酵能較好地抑制大腸桿菌，對果糖和葡萄糖利用率最高，乳酸產量最高，發酵周期最短；溫度對泡菜發酵中蔗糖利用率無顯著影響。

關鍵詞溫度；泡菜；乳酸菌；酵母菌；代謝

傳統四川發酵泡菜是利用蔬菜表面附著的微生物進行自然發酵。一年四季時令分明，作為餐桌上最普遍的家庭美食之一，溫度的變化會對泡菜的品質造成一定影響，增加了泡菜工業化的難度[1]。從已有的研究來看[2-4]，有關溫度對泡菜中微生物消長的研究較多，而針對性的研究溫度對泡菜發酵過程微生物的消長、底物消耗、代謝產物合成的關聯性研究較少。本實驗結合四川地區四季溫度變化特點，制作了高、中、低溫3種恒溫發酵泡菜。利用不同的選擇性培養基對3種泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌以及大腸桿菌進行計數，并利用高效液相色譜技術(high performance liquid chromatography，HPLC)對發酵過程中有機酸及糖醇的變化進行分析，研究了3個不同溫度對傳統四川泡菜發酵過程中微生物的結構變化、代謝底物和產物含量變化的影響，旨在揭示溫度對泡菜發酵特性的影響，期望對傳統自然發酵泡菜的食用安全及工業化生產提供科學依據和理論指導。

1材料與方法

1.1材料、培養基與試劑

新鮮圓白菜、冰糖、碘鹽、辣椒、姜、大蒜、花椒均為市售。酵母菌分離計數培養基：虎紅培養基，北京奧博星公司。乳酸菌分離計數培養基：MRS培養基，參照GB 4789.35—2010《食品衛生微生物學檢驗——食品中乳酸菌檢驗》方法配制。大腸桿菌分離計數培養基：結晶紫中性紅膽鹽瓊脂，北京奧博星公司。蔗糖、果糖、葡萄糖、乙酸、乙醇、乳酸(分析標準品)，美國Sigma公司；濃硫酸、無水乙醇、氫氧化鈉、氯化鐵、氯化鈉(分析純)，上海國藥集團化學試劑公司。

1.2儀器與設備

pHS-25型pH計，上海精密科學儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Airtech生物安全柜，蘇凈集團安泰公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Aminex-87H色譜柱，美國伯樂公司；DNP-9272型生化培養箱，上海精宏實驗設備有限公司；

1.3實驗方法

1.3.1傳統四川泡菜的制作工藝及配方

傳統四川泡菜工藝：

圓白菜→清洗→瀝干→切分→裝壇→密封→發酵→成品

↑鹽水(花椒等輔料)

傳統四川泡菜配方：100mL水中，添加白菜50 g，冰糖4 g，碘鹽4 g，辣椒4 g，大蒜3 g，生姜2 g，花椒1.5 g。

1.3.2取樣

泡菜從入壇開始直至發酵第7天，期間每隔12 h于超凈工作臺內進行取樣。

1.3.3pH值的測定

使用pHS-25型pH計測定發酵液中的pH。

1.3.4乳酸菌和酵母菌的分離計數

無菌條件下，取1 mL發酵液于裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，搖勻，制成1∶10稀釋菌懸液，按每級10倍的梯度稀釋。選擇合適梯度，分別涂布于MRS培養基置于37 ℃培養48 h、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂置于37 ℃培養24 h、虎紅培養基置于30 ℃培養3～5 d后計數，每個梯度做2個平行涂布。

1.3.5發酵液中有機酸和糖醇的分析

將發酵液經離心(10 000 r/min，10 min)后取上清液，過0.22 μm水系濾膜后用于高效液相色譜分析。色譜條件：流動相為6 mmol/L硫酸溶液，進樣量20 μL，流速為0.5 mL/min，柱溫45 ℃，紫外檢測器檢測波長為205 nm。示差折光檢測器用于檢測糖醇(蔗糖、葡萄糖、果糖、乙醇)含量，紫外檢測器用于檢測有機酸(乳酸、乙酸)含量。

2結果與分析

2.1泡菜發酵過程中微生物的變化

多種微生物共同作用是傳統四川發酵泡菜形成的關鍵，乳酸菌和酵母菌對泡菜中風味物質的形成起主要作用[5]，同時，泡菜發酵的過程也會伴隨著一些致病菌的生長繁殖，其中大腸桿菌是泡菜中典型的致病菌，影響泡菜的風味以及食用安全性[6]，故監測乳酸菌、酵母菌以及大腸桿菌的變化對研究發酵泡菜有重要意義。

圖1　泡菜發酵過程中乳酸菌、酵母菌和大腸桿菌的變化Fig.1　The changes of lactic acid bacteria,yeast and Escherichia coli during the fermentation

如圖1-A所示，3種不同溫度下發酵的傳統四川泡菜中，乳酸菌初始菌數均處于104CFU/mL，2.5天內增加至108CFU/mL，其菌數在發酵中后期無明顯變化。但是在37、28、18 ℃發酵泡菜初期，乳酸菌的生長情況有較大差異，分別于0.5、1、2.5天增長至108CFU/mL。這可能由于溫度越高(一定范圍內)乳酸菌生長遲滯期越短，繁殖越快，造成乳酸菌在3種溫度下發酵泡菜前期的明顯差異。在泡菜發酵中后期，鹵水中有機酸的不斷積累以及泡菜體系中底物的持續消耗，使乳酸菌數在發酵后期呈現略微的下降但未有明顯的變化。

泡菜發酵過程中酵母菌的變化如圖1-B所示，泡菜發酵的前1天酵母菌迅速繁殖，此后，在不同的溫度條件下泡菜鹵水中酵母菌的變化表現出明顯差異。37 ℃和28 ℃發酵泡菜時酵母菌先增至105CFU/mL，隨后快速消亡，分別在第3天和第4天完全消亡；而18 ℃發酵的泡菜鹵水中酵母菌在第1天至第4天菌數穩定在104CFU/mL，隨后逐漸下降并于第6天完全消亡，可見溫度越高，酵母菌消失的越快。這可能是溫度越高，泡菜體系中乳酸菌生長繁殖越迅速，其主要代謝產物乳酸也隨之增加，而酵母菌的耐酸性能比較差，乳酸的積累對酵母菌有較強的抑制作用；另有研究表明乳酸菌代謝產生的化合物如苯乳酸、環肽等也會抑制酵母菌的生長[7]。

大腸桿菌發酵過程中的變化規律(圖1-C)與酵母菌相似，不同的是酵母菌在37 ℃時消亡最快，而大腸桿菌則是在28 ℃時消亡最快。值得注意的是低溫環境發酵泡菜時大腸桿菌受到的抑制作用較弱，直至第7天泡菜體系中的大腸桿菌才完全消失。腐敗菌如大腸桿菌會將蔬菜中的蛋白質水解并轉化為亞硝酸鹽，對人體健康不利[8]，故在冬天制作傳統四川泡菜時需要延長泡菜的發酵周期。

2.2泡菜發酵過程中發酵液pH值的變化

pH是微生物代謝活動的一項指標，同時也是影響微生物生長的重要因素，是一項重要的發酵參數[9]。泡菜發酵初期，乳酸菌迅速繁殖代謝并產生大量乳酸，使泡菜鹵水pH值顯著下降。

圖2表現的是在3種不同溫度下泡菜發酵過程中鹵水pH的變化。在發酵前期鹵水pH均迅速下降，中后期下降速度減緩。然而，泡菜發酵的前2天，37℃發酵的泡菜鹵水pH下降速度較另兩者快；在泡菜發酵終止時，18℃下發酵的泡菜鹵水pH(pH=3.6)較另兩者(它們的最終pH均為3.2)高。

圖2　泡菜發酵過程中pH值的變化Fig.2　The changes of pH during the fermentation

泡菜發酵前3天腸膜明串珠菌等異型發酵菌迅速繁殖并代謝產酸使鹵水pH值急劇下降，然而18℃下鹵水pH值下降較其他兩個溫度緩慢，一方面低溫環境下泡菜發酵前期乳酸菌增殖較慢，乳酸菌數較其他兩個溫度低，產酸也較少；另一方面，可能在低溫條件下乳酸發酵途徑中酶(如醛縮酶、乳酸脫氫酶)的活性較低[10]，影響乳酸菌產酸，從而減緩了鹵水pH值的下降。發酵中后期，乳酸菌的繁殖代謝因鹵水中的乳酸和H+大量積累而受到抑制[11]，乳酸代謝途徑因乳酸的積累產生反饋抑制作用[12]，使鹵水pH逐步趨于穩定。然而18℃發酵泡菜中鹵水pH值在第7天只下降至3.6(其他兩個溫度穩步下降直至3.2)，泡菜發酵周期大大延長。可見，在自然發酵泡菜中溫度對鹵水pH值影響顯著，而鹵水pH值的變化取決于微生物代謝產生有機酸的含量。

2.3泡菜發酵過程中主要底物含量的變化

乳酸菌的生長代謝需要碳源，泡菜發酵體系內主要碳源是蔗糖、果糖和葡萄糖，主要來源于制作時加入的冰糖，其次蔬菜中原有的糖類也會浸出至鹵水中[13]。

圖3　泡菜發酵過程中主要底物的變化Fig.3　The changes of substrate concentrations during the fermentation

圖3表示的是泡菜發酵過程中主要底物的變化規律。由圖3-A可知蔗糖在整個發酵過程中均有代謝利用。發酵前期乳酸菌的快速生長繁殖對碳源的需求極大；此外，一些細菌和真菌代謝也能利用蔗糖[14]，導致蔗糖被大量代謝，含量迅速下降。隨著發酵的進行，發酵過程漸漸由異型乳酸(如腸膜明串珠菌)發酵主導轉變為同型乳酸發酵(如植物乳桿菌)主導[15]，而植物乳桿菌較腸膜明串珠菌對蔗糖的利用能力更差[16]，但是3個溫度下發酵泡菜中乳酸菌在中后期能保持較高的活菌數(108CFU/mL)，導致泡菜在發酵后期依然對蔗糖保有一定的利用率，使得不同溫度下蔗糖的利用率無顯著差異。從圖3-B中可以看出發酵泡菜中葡萄糖在前期均快速上升，一方面，在泡菜發酵前期如腸膜明串珠菌可以產生葡萄糖蔗糖酶將蔗糖轉換化為葡萄糖[17]，另一方面，圓白菜組織中的葡萄糖也能通過滲透作用滲出至鹵水中。中后期葡萄糖含量均緩慢上升，其中18 ℃發酵泡菜的葡萄糖含量明顯高于其他兩個溫度，可能是由于酵母菌在該環境中消亡更慢，已有研究表明泡菜中的一些細菌(如醋酸菌)和真菌(如酵母菌和霉菌)的繁殖也會代謝蔗糖產生葡萄糖和果糖[14]；另外作為產乳酸的前體物質[18]，葡萄糖在高溫情況下利用率更高，導致低溫條件下葡萄糖殘留量遠高于其他兩個溫度。果糖同樣作為酵母菌代謝蔗糖的產物，其變化規律和葡萄糖大致類似，發酵過程中始終保持上升的趨勢，在低溫時殘量最高。

2.4泡菜發酵過程中主要代謝產物含量的變化

乳酸是泡菜體系中最主要的有機酸，是乳酸菌代謝的重要產物[19]，乳酸主要來源于同型乳酸發酵代謝途徑，以1個葡萄糖分子為底物，經糖酵解途徑降解產生2分子丙酮酸，后者再作為氫接受體被還原成2分子乳酸，并產生2分子ATP[20]，乳酸含量直接影響泡菜的風味和泡菜體系中菌的分布和穩定性。

圖4　泡菜發酵過程中代謝產物的變化Fig.4　The chang of metabolic products during the fermentation

圖4-A表示了乳酸在不同溫度下傳統四川泡菜發酵過程中的變化趨勢，其含量在發酵前1.5天均緩慢升高，第1.5～4.5天快速積累，之后又緩慢升高。盡管乳酸菌在泡菜發酵的前2天已增至108CFU/mL，與此同時蔗糖也被大量消耗，乳酸的積累量卻并不大。一方面可能是主導泡菜前期發酵的異型乳酸菌如腸膜明串珠菌產酸能力較弱；另一方面泡菜體系中中存在如霉菌、酵母菌等微生物能代謝蔗糖但不產生乳酸。泡菜發酵中后期，鹵水中乳酸和H+隨著發酵的進行大量積累，導致乳酸含量快速上升。37℃時泡菜可能提前進入同型發酵階段，主導泡菜發酵的同型乳酸菌如植物乳桿菌產酸能力較強[21]，在代謝利用等量的碳源比異型發酵能產生更多的乳酸，而18℃環境中乳酸菌生長代謝速率緩慢，如腸膜明串珠菌等異型發酵菌株產乳酸能力較弱，導致乳酸含量上升緩慢并一直低于其他兩個溫度。整體而言，乳酸的產量與溫度(在一定范圍內)呈正比關系。

乙酸是乳酸菌經過異型乳酸發酵途徑的產物之一，適量的乙酸對泡菜風味物質具有促進作用[22]。泡菜發酵前期，微生物迅速生長代謝并產生乙酸，使其含量有一定的增加。發酵中后期，pH的下降使得不耐酸的異型發酵菌逐漸死亡，乙酸含量逐漸趨于穩定并呈略微的下降。可能是18℃發酵泡菜中異型乳酸菌存活時間更長導致鹵水中乙酸的含量較其他兩個溫度高。

圖4-C描述了乙醇含量的變化趨勢。前期發酵環境較適合微生物生長，酵母菌和其他異型發酵菌株迅速繁殖并代謝蔗糖產生乙醇，使其含量迅速上升。到中后期異型發酵菌株相繼消亡使得乙醇的含量逐漸趨于穩定。18℃ 環境中乙醇的含量遠高于其他兩個溫度，可能是低溫下酵母菌存活時間最長導致其乙醇含量最高，這驗證了泡菜體系中的乙醇主要來源于酵母菌的代謝。

3結論與展望

通過對不同溫度下的傳統四川泡菜發酵研究表明，溫度越高,乳酸菌、大腸桿菌和酵母菌在發酵前期繁殖越快，同時大腸桿菌和酵母菌的消亡時間也越短。泡菜鹵水pH值下降速率與溫度成正比，18 ℃下泡菜發酵至第7天時鹵水pH值為3.6，尚未達到成熟。碳源方面，溫度對蔗糖的利用無顯著影響；葡萄糖和果糖在37℃下發酵時，它們的利用速率要顯著快于另兩個溫度下的發酵。代謝產物方面，低溫時乙醇和乙酸的含量較高，乳酸的產量與溫度成正比；綜上所述，37℃環境中乳酸菌的繁殖代謝最快，乳酸產量最高，能較好的抑制大腸桿菌，對葡萄糖和果糖的利用率最高，大大縮短了發酵周期。溫度的改變對泡菜發酵過程中菌系的消長、微生物的代謝影響顯著，不僅表現在泡菜發酵周期和各指標差異明顯，更重要的是對泡菜食用安全造成一定影響?？蛇M一步研究溫度對亞硝酸含量以及泡菜風味的影響，進而為我國泡菜工業化生產提供理論依據。

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Effects of temperature on strains and metabolism of Sichuan pickled cabbage

XIONG Tao*,XIAO Yang-sheng, LI Jun-bo, PENG Fei, HUANG Tao

(State Key Laboratory of Food Science and Technology, College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

ABSTRACTThe traditional Sichuan pickled cabbage naturally fermented at different temperature (18, 28, 37℃) was studied, by comparing the pH values of the brine and the main microorganisms including lactic acid bacteria, yeast and Escherichia coli and monitoring the content changes of sugars (sucrose, glucose, fructose), organic acids (lactic acid and acetic acid), ethanol. Results showed that temperature had a significant influence on the changes of microorganisms and metabolism during the sichuan pickle cabbage fermentation. Lactic acid bacteria grew faster and pH value decrease more quickly at high temperature. Yeast and E.coli had the longest survival time and longest period of fermentation. At 28℃，it showed better inhibition on the growth of E.coli, while the reproduction of fructose and ethanol were the lowest. The utilization of glucose and fructose was outstanding and the yield of lactic acid was the highest at 37℃, fermentation cycle was also shortened. The temperature had no significant effect on the utilization of sucrose.

Key wordstemperature; pickled cabbage; microorganisms；metabolism

收稿日期：2015-07-15，改回日期：2015-09-08

基金項目：國家自然科學基金項目(31560449)；國家“十二五”首批863計劃(2011AA100904)；“贛鄱英才555工程”領軍人才培養計劃項目(18000063)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602014

第一作者：博士生導師，教授(本文通訊作者，E-mail:xiongtao0907@163.com)。