3株太湖溶藻細菌的分離及溶藻特性的初步研究

劉征宇，寧喜斌，李文利，王志堅，山樹斌，李曉暉

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

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3株太湖溶藻細菌的分離及溶藻特性的初步研究

劉征宇，寧喜斌，李文利，王志堅，山樹斌，李曉暉*

(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

摘要選擇藻華現(xiàn)象嚴重的太湖作為采樣點，取6個不同位置的水樣加入含有對數(shù)期藻液的三角瓶中，取藻液有黃化現(xiàn)象的對應(yīng)水樣作為分離溶藻細菌的材料，初篩得到21株細菌，其中3株細菌表現(xiàn)出較強的溶藻作用，編號分別為A09、A10、A21。經(jīng)6 d溶藻實驗，菌株A09、A10、A21對Microcstis aeruginosa 905藻細胞清除率分別達到93.11%、88.71%、97.20%，葉綠素a清除率分別為87.63%、83.48%、93.16%，溶藻能力A21> A09 > A10，均為高效的溶藻細菌。經(jīng)生理生化鑒定及16S rDNA 分子鑒定，A09菌株為鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium sp.)、A10菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、A21號菌株為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。3株溶藻細菌的溶藻機制均為胞外釋放某種物質(zhì)進行間接溶藻，且這種或幾種物質(zhì)具有極強的熱穩(wěn)定性，屬于非蛋白類物質(zhì)。

關(guān)鍵詞溶藻細菌；銅綠微囊藻；鞘氨醇桿菌;解淀粉芽孢桿菌; 蠟狀芽孢桿菌；太湖

隨著全球水體富營養(yǎng)化的加劇，有害藻類水華和赤潮的爆發(fā)日趨頻繁造成嚴重的環(huán)境和經(jīng)濟問題[1-2]。為了解決這一問題，人們采用了物理法(直接打撈、過濾、超聲波等)、化學(xué)法(藥劑殺滅法、絮凝劑沉法等)和生物法等[3]，但物理法控藻費用高，難以大面積使用；而化學(xué)法控藻容易產(chǎn)生二次污染，造成環(huán)境污染或生態(tài)平衡的破壞，甚至給人類帶來更多危害。因此，人們把更多的目光投向了生物法控藻[4]。

溶藻細菌(Algicidalbacteria)是以直接或間接方式抑制藻類生長或殺死藻類，溶解藻細胞的細菌的統(tǒng)稱，是水生態(tài)系統(tǒng)生物種群結(jié)構(gòu)和功能的重要組成部分，對維持藻生物量平衡具有非常重要的作用[1]。溶藻細菌及其活性代謝產(chǎn)物的開發(fā)已經(jīng)成為水體藻污染生物防治的新舉措。溶藻細菌的研究在國外已有數(shù)十年歷史。早在1924年, GEILER報道一種粘細菌Polyangiumparasitium寄生在剛毛藻Cladophora上，使藻死亡[5]。溶藻細菌在國內(nèi)外文獻中陸續(xù)有一些報道[6-12]，這些細菌多為革蘭氏陰性菌，它們的作用對象比較廣泛，既有藍藻,也有硅藻和甲藻。本文的主要目的是采用原位取樣法分離太湖水域中的溶藻細菌，在研究溶藻細菌的分離、鑒定及溶藻機制的基礎(chǔ)上，為利用溶藻微生物治理水華提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試藻種

銅綠微囊藻905(Microcstisaeruginosa905)購于中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫——淡水藻種庫，培養(yǎng)條件為28 ℃、光照強度2 000 lx光暗比14 h∶10 h[11]，預(yù)培養(yǎng)1周。

1.1.2主要試劑

營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂用于溶藻細菌的分離與純化；銅綠微囊藻的培養(yǎng)基BG11培養(yǎng)基用于銅綠微囊藻的培養(yǎng)。

1.1.3主要儀器

智能型光照培養(yǎng)箱SPX-250PG，上海天恒醫(yī)療機械有限公司，；紫外可見分光光度計SQ-UV2300，北京宇艾奇電子科技有限公司；光學(xué)顯微鏡CX21，OLYMPUS；瓊脂糖水平電泳儀DYCP-32B，北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)GelDoc XR+，Bio-Rad美國伯樂公司；血球計數(shù)板，求精儀器；多管架自動平衡離心機TDZ5-WS，湘潭湘儀儀器有限公司；臨界點干燥儀，英國Quorumm/Emitech)；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1水樣采集

本實驗的水樣取樣方法為原位取樣法[12]，即分離細菌的水樣采至太湖發(fā)生水華現(xiàn)象水域，用滅菌的錐形瓶取水表面5 cm以下水樣，低溫避光保藏，共設(shè)置6個不同位置的取樣點。

1.2.2溶藻水樣篩選和溶藻細菌的分離

初篩：取10 mL水樣直接感染90 mL對數(shù)生長期的M.aeruginosa905，按1.1.1的方法靜置培養(yǎng)7 d左右，每天觀察并記錄藻的生長情況。若有水樣出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，取該黃化水樣按1∶9的比例加入新鮮對數(shù)生長期的藻液中觀察溶藻現(xiàn)象，對仍具有溶藻現(xiàn)象的水樣，重復(fù)上述操作3次。如仍有溶藻能力，將樣品梯度稀釋，用營養(yǎng)瓊脂平板分離黃化藻液的細菌[13]。

復(fù)篩：純化后的細菌接入到營養(yǎng)肉湯中37 ℃ 培養(yǎng)24 h[14]。取1 mL菌液加入9 mL生長對數(shù)期的M.aeruginosa905，取無菌營養(yǎng)肉湯按上述方法加入作為對照組，1.1.1方法混合培養(yǎng)7 d觀察是否有黃化現(xiàn)象。若有，該細菌為溶藻細菌。

1.2.3溶藻細菌生長曲線的測定

取5.0 mL培養(yǎng)18 h的溶藻菌培養(yǎng)液加入100 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每2 h取樣，用紫外可見型分光光度計在600 nm處測量吸光度[15]。

1.2.4菌種生理生化及分子鑒定

形態(tài)觀察及生理生化鑒定根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》[17]。

16S rDNA 序列測定及同源性分析： 1) 基因組 DNA提取用蛋白酶K法[18]。2)PCR 擴增及序列測定：用通用引物[19](正向27f： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向1492R： 5′-GGTTACCTTG￣TTACG￣ACTT-3′)進行PCR擴增， PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測純化后，送上海生工測序。3 )數(shù)據(jù)處理：測序結(jié)果用Chromas軟件拼接、將序列提交到Genebank中進行Blast比對并用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5銅綠微囊藻藻細胞數(shù)量變化的測定

取1 mL有黃化現(xiàn)象的藻菌培養(yǎng)液，用血球計數(shù)板在顯微鏡下用5點法記錄藻細胞數(shù)量，按公式(1)[20-22]計算細菌的溶藻能力(A) ：

A/%=(1-Dt/Dc)×100

(1)

其中：Dt(cell/mL)和Dc(cell/mL)分別指培養(yǎng)到計數(shù)當天實驗組和對照組的藻細胞濃度。

1.2.6銅綠微囊藻葉綠素a濃度的測定[23-24]

取4 mL有黃化現(xiàn)象的藻菌培養(yǎng)液，離心取沉淀，加入等體積的90 %丙酮充分混勻，離心管用鋁箔紙包裹，在冰浴條件下超聲處理(200 W,5 s超聲，5 s間隙，20個循環(huán))，然后將所有提取液放置在黑暗低溫的環(huán)境中萃取12～18 h(不得超過24 h)。將提取液放入冷凍離心機中離心，轉(zhuǎn)速12 000 r/min下離心20 min，將上清液移入試管，分別在 630、647、664和 750 nm下測定吸光度。葉綠素a含量計算:

C(mg/L)=11.85(A664-A750)-1.54(A647-A750)-0.08(A630-A750)

(2)

其中：A664、A647、A630、A750分別表示提取液在波長為664、647、630和 750 nm時的吸光度。

根據(jù)公式(3)計算細菌的溶藻能力(A) :

A/%=(1-Dt/Dc) ×100

(3)

其中：Dt和Dc分別指培養(yǎng)到計數(shù)當天實驗組和對照組的葉綠素a濃度。

傳統(tǒng)教學(xué)模式下，采用固定的課本，在很大程度上限制了學(xué)生的思維。因為那些教材內(nèi)容陳舊，即使更新教材，但大多數(shù)的知識還是沿用原有內(nèi)容，有的甚至原文照搬，新的知識點幾乎沒有補充。而且一本書從編寫、修正到印刷出版，再到學(xué)生手中，需要經(jīng)歷很長一段時間，這其中的種種原因，導(dǎo)致學(xué)生所接觸到的知識與他們所需要的知識相脫節(jié)，對學(xué)生的學(xué)習(xí)形成很大制約，培養(yǎng)的人才與社會需求不相匹配。再者，傳統(tǒng)教學(xué)模式學(xué)生只會學(xué)習(xí)本專業(yè)知識，很少甚至不涉獵其他專業(yè)知識。而隨著專業(yè)之間的相互滲透與交叉，社會需要精通多個領(lǐng)域的復(fù)合型人才。基于此，高校需要改變傳統(tǒng)教學(xué)模式，培養(yǎng)適應(yīng)時代需求的戰(zhàn)略性人才。

1.2.7溶藻實驗

1.2.7.1高效溶藻細菌對銅綠微囊藻生長的影響

取復(fù)篩得到的高效溶藻細菌經(jīng)過2次營養(yǎng)瓊脂復(fù)壯后在最適溫度下接種于新鮮營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，稀釋到同一濃度(109CFU/mL),將幾種菌液分別以6%的接種量與100 mL對數(shù)生長期的M.aeruginosa905藻液混合，在150 mL的錐形瓶中培養(yǎng)。取相應(yīng)量的無菌的營養(yǎng)肉湯與生長對數(shù)期的M.aeruginosa905藻液混合作為對照組，按照1.1.1的方法培養(yǎng)，每天觀察并記錄藻液的顏色變化和生長情況。

1.2.7.2高效溶藻細菌溶藻方式的探究

為探討溶藻細菌的溶藻方式，將復(fù)篩得到的高效溶藻細菌在最適溫度下培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)液進行如下處理：

(1)菌體破碎：細菌培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清液，用生理鹽水洗滌菌體2次，BG11重懸，超聲破碎菌體。

(2)菌液：不做任何處理。

(3)離心過濾菌液上清：細菌培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min，4 ℃離心10 min，用0.22μm玻璃纖維濾膜過濾上清液2次。

(4)高熱處理菌液上清液：細菌培養(yǎng)液經(jīng)8 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液用121℃，高溫滅菌20 min。

2實驗結(jié)果與分析

2.1溶藻水樣篩選及溶藻細菌的分離

初篩：對太湖6個水樣進行溶藻實驗，通過反復(fù)篩選，水樣3、6具有溶藻效應(yīng)，實驗5 d的結(jié)果如圖1所示。水樣3和6對M.aeruginosa905的溶藻效果非常好，藻細胞濃度分別由1.11×106cell/mL、1.15×106cell/mL下降至1×105cell/mL、8.9×104cell/mL，溶藻效率可達到91.99 %和92.26 %，藻液顏色由綠色變淡色。這說明水樣3和6中可能含有高效的抑藻微生物，因此將此兩組黃化水樣用于溶藻細菌的分離。

圖1　溶解M. aeruginosa 905水樣初選結(jié)果Fig.1　Algicidal selection results of water samples

復(fù)篩：從黃化水樣中初篩共分離出21株細菌，分離所得菌株對M.aeruginosa905均有抑制作用，抑藻效率在10.9%到81.14%不等。進行復(fù)篩后，其中有3株細菌溶藻效果較為明顯，分別為A09、A10和A21。這3株溶藻細菌在8d里對藻細胞濃度的影響如圖2所示，溶藻效率分別為67.03% 、65.98%、81.14%，其他菌株溶藻效率均在50%以下。

圖2　A09、A10和A21對M. aeruginosa 905生長的影響Fig.2　The effect ofA09，A10 and A21 on the M. aeruginosa 905

2.2溶藻細菌的生長曲線

3株溶藻細菌的生長曲線如圖3所示。可以看出，A09在2 h內(nèi)處于遲緩期，2 h后即進入對數(shù)生長期，16 h進入穩(wěn)定期。A10遲緩期也為2 h，隨后進入對數(shù)生長期，16 h進入穩(wěn)定期。A21遲緩期不明顯，快速進入對數(shù)生長期，6 h進入穩(wěn)定期。由于采用比濁法測定細菌濃度，因此并未觀察到明顯的衰亡期。3株溶藻細菌總體生長速度A21>A10 >A09。最適生長溫度A09、A10為30 ℃，A21為37 ℃。

圖3　A09、A10和A21的生長曲線Fig.3　The growth curve of A09，A10 and A21

2.3溶藻細菌的鑒定

2.3.1形態(tài)觀察及生理生化實驗

A09為革蘭氏陰性菌，菌落形態(tài)呈不透明淡黃色，單菌落為圓形，邊緣整齊，表面凸起且光滑，質(zhì)地粘稠。A10為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)呈不透明黃色，圓形，邊緣整齊，表面凸起且光滑，質(zhì)地粘稠。A21為革蘭氏陽性菌，菌落形態(tài)呈不透明乳白色，圓形，邊緣不整齊，表面凸起且粗糙，質(zhì)地濕潤。菌落形態(tài)如圖4所示，3株溶藻細菌菌落觀察及生理生化實驗結(jié)果如表1所示。

圖4　A09、A10和A21的菌落形態(tài)Fig.4　Strain form of A09，A10 and A21

特征A09A10A21菌落形態(tài)圓形圓形圓形菌落顏色淺黃黃色白色表面狀態(tài)光滑光滑粗糙菌落光澤有光澤有光澤有光澤干濕程度濕潤極濕潤濕潤細菌形狀桿狀桿狀桿狀革蘭氏染色-++芽孢染色-++莢膜染色---氧化酶實驗+--接觸酶實驗+++葡萄糖產(chǎn)酸+++麥芽糖產(chǎn)酸+++乳糖產(chǎn)酸+++木糖產(chǎn)酸+++運動性+++30℃生長+++++37℃生長++++

2.3.2溶藻細菌的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測3株溶藻細菌的16S rDNA 擴增產(chǎn)物， 均得到特異性條帶， 片段大小為1 500 bp左右，用BLAST程序?qū)09、A10和A21的16S rDNA 序列與Genbank中已經(jīng)登錄的16S rDNA序列進行核苷酸序列同源性比較，結(jié)果表明A09為鞘氨醇桿菌(sphingobactiumsp)，A10為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、A21為蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，3株細菌的基因序列相似性均達到99%。A09、A10和A21的電泳圖譜、系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5、圖6所示。

圖5　A09、A10和A21的16S rDNA電泳圖譜Fig.5　The electrophoretogram of DNA and PCR products of A09，A10 and A21

圖6　A09、A10和A21的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6　Phylogenetic tree of A09，A10 and A21

2.43株溶藻細菌的溶藻實驗

2.4.13株溶藻細菌對銅綠微囊藻生長的影響

3株溶藻細菌對微囊藻細胞數(shù)及葉綠素a的抑制效果如圖7、圖8所示，由圖可見溶藻細菌A09、A10、A21均有很明顯的溶藻效果。實驗第6天對照組藻細胞數(shù)為1.68×107cell/mL，經(jīng)A09、A10、A21處理后的藻液中藻細胞濃度分別為1.16×106cell/mL、1.90×106cell/mL和4.71×105cell/mL，藻細胞清除率分別達到93.11%、88.71%和97.20%，溶藻效果A21> A09> A10，實驗第8天經(jīng)A21處理的藻液已觀察不到成形的藻細胞。葉綠素a的清除效果與實驗時間成正比，實驗第6d A09、A10、A21葉綠素a清除率分別為87.63%、83.48%和93.16%，實驗第8天 3株溶藻細菌的葉綠素a清除率均在90%以上。

圖7　A09、A10和A21對銅綠微囊藻濃度的影響Fig.7　The effects of A09，A10 and A21 on the M. aeruginosa 905 cell concentration

圖8　A09、A10和A21對銅綠微囊葉綠素a的清除率Fig.8　The influences of A09，A10 and A21 on the removing chlorophyll rate

2.4.23株溶藻細菌溶藻方式的探討

實驗表明,溶藻細菌A09、A10、A21的菌液、過濾上清液以及高溫處理后的上清液均有明顯溶藻效果，相比之下其菌體破碎組的溶藻效果并不明顯。實驗第6天，與對照組的1.96 mg/L相比，A09、A10、A21過濾上清液處理組葉綠素a含量分別為0.18mg/L、0.17mg/L和0.13mg/L，葉綠素a的清除率分別為 90.81%、91.25%和 93.07%，清除效果顯著。且A09、A10、A21的過濾上清液處理組與原菌液的清除率幾乎相同, 說明它們的溶藻方式不是直接溶藻, 而是通過釋放某種胞外物質(zhì)進行間接溶藻。同時A09、A10、A21經(jīng)過高溫處理后的高熱上清組也有明顯的溶藻效果, 葉綠素a的清除率分別為 89.60%、91.30%和 94.20%，與濾上清組效果幾乎相同，說明它們胞外釋放的溶藻物質(zhì)具有很強的熱穩(wěn)定性，屬于非蛋白質(zhì)類物質(zhì)。

圖9　A09、A10和A21溶藻方式的探討Fig.9　The results of mechanism of A09，A10 and A21

3結(jié)果與討論

本研究從太湖水樣中分離得到21株具有溶藻特性的菌株，通過其水華優(yōu)勢藻種銅綠微囊藻905在實驗室條件下測定溶藻能力確定菌株A09、A10、A21為高效的溶藻細菌。菌株A09、A10、A21通過菌落形態(tài)觀察、部分生理生化實驗及16S rDNA分子實驗進行鑒別，3株溶藻細菌分別為鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumsp)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)。目前已報道的溶藻細菌以革蘭氏陰性居多，本實驗篩選結(jié)果為一株革蘭氏陰性菌，兩株革蘭氏陽性菌，陽性菌數(shù)量多于陰性菌，且唯一的革蘭氏陰性菌A09為溶藻方面報道較少的鞘氨醇桿菌，并顯示出了良好的溶藻效果。A10為解淀粉芽孢桿菌，與許波[25]、于靚[26]分離的溶藻細菌屬于同一菌種。A21為蠟狀芽孢桿菌，與劉晶[27]、史順玉[28]分離的溶藻細菌屬于同一菌種。溶藻實驗6d后，菌株A09、A10、A21的藻細胞去除率分別為93.11%、88.71%、97.20%，葉綠素a清除率分別為87.63%、83.48%、93.16%，均為高效的溶藻細菌。

細菌溶藻方式一般有2種：直接溶藻與間接溶藻。直接溶藻即細菌直接進攻宿主，與藻細胞直接接觸，甚至侵入藻細胞內(nèi)。間接溶藻指溶藻細菌同藻類競爭營養(yǎng)物質(zhì)或分泌特異性或非特異性的胞外溶藻物質(zhì)殺死藻類，如氨基酸、多肽、抗生素、蛋白質(zhì)等等，其中分泌胞外溶藻物質(zhì)是溶藻的主要方式。本實驗通過溶藻方式探討發(fā)現(xiàn)這3株細菌均通過胞外釋放某種物質(zhì)進行間接溶藻，且該種或幾種物質(zhì)具有極強的熱穩(wěn)定性，顯然不屬于蛋白類物質(zhì)。間接溶藻的機理一般為溶藻物質(zhì)通過生理過程如抑制細胞壁生成、阻斷呼吸鏈、破壞藻細胞膜的完整性及減弱光能轉(zhuǎn)化效率等達到抑藻效果。那么在A09、A10和A21的濾過上清液溶藻過程中，藻液體系中的丙二醛含量(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、藻細胞結(jié)構(gòu)損傷程度、光能轉(zhuǎn)化效率及電子傳遞速率如何變化，將是下一階段研究的重點。

利用細菌來防治水華和赤潮等環(huán)境問題已成為主流，菌株A09、A10和A21對藍藻水華的優(yōu)勢藻種(銅綠微囊藻)有顯著的抑制效果，為藍藻水華的防治提供了新的選擇。通過對其溶藻特性的逐步深入研究，揭示溶藻機理及特性，有望加深對菌藻關(guān)系以及其相互作用的理解。

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Isolation and primary study of three algicidal bacteria strains of Tai lake

LIU Zheng-yu, NING Xi-bin,LI Wen-li, WANG Zhi-jian,SHAN Shu-bin,LI Xiao-hui*

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing and Preservation,Shanghai 201306, China)

ABSTRACTWater samples were collected at six sampling points of Tai lake, a eutrophic and algal bloom lake. The culture was mixed with test anabaena in log phase. Strains were isolated from the yellowing algae culture via repeat tests. Among 21 isolates, three bacterial strains A09, A10 and A21 presented relatively strong ability of Algal-lysing in Microcstis aeruginosa 905. The clearance rates of algal cells in six days were 93.11 %, 88.71 % and 97.20 %, and the rates of removing chlorophylla were 87.63 %, 83.48 % and 93.16 % respectively. The algal-lysing ability from high to low was as follows: A21> A09 > A10. Physiology biochemistry experiments and 16S rDNA molecular detection were carried out for strain identification. A09，A10 and A21 were assigned to Sphingobacterium sp, Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus cereus, respectively. A09, A10 and A21 were proved indirectly to dissolve algae. Results showed that the three strains could secrete one or several kinds of small nonprotein molecules with resistance to high temperature and high pressure to dissolve algae.

Key wordsAlgicidal bacteria; Microcstis aeruginosa; Sphingobacterium sp.;Bacillus amyloliquefaciens; Bacillus cereus; Tai lake

收稿日期：2015-09-15，改回日期：2015-11-13

基金項目：上海市科委工程中心建設(shè)項目(11DZ2280300)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602011

第一作者：碩士研究生(李曉暉副教授為通訊作者，E-mail:xhli@shou.edu.cn)。