蒸餾廢液中金屬離子對木薯淀粉液化過程的影響及優(yōu)化

楊圣乾，張建華，毛忠貴，王柯

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

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蒸餾廢液中金屬離子對木薯淀粉液化過程的影響及優(yōu)化

楊圣乾，張建華，毛忠貴*，王柯

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

摘要蒸餾廢液回用可有效減少酒精生產(chǎn)中的廢水排放量，但會導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)巧摺Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)，蒸餾廢液對液化過程的抑制是造成殘?zhí)巧叩闹饕颉Ｎ闹锌疾炝苏麴s廢液中金屬離子對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活及二級結(jié)構(gòu)(ɑ-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲)的影響。結(jié)果表明，在對應(yīng)濃度下(與蒸餾廢液中的濃度一致)，Na+(55.89 mmol/L)和K+(33.27 mmol/L)對淀粉酶酶活沒有影響；Al(3+)(3.85 mmol/L)和Li+(0.98 mmol/L)對酶活有輕微抑制；Mg(2+)(7.24 mmol/L)和Ca(2+)(3.87 mmol/L)對酶活有促進作用；Fe(3+)(1.40 mmol/L)使酶活下降19.18%。淀粉酶二級結(jié)構(gòu)中ɑ-螺旋含量下降可能是Fe(3+)造成酶活下降的原因。蒸餾廢液中加入16mmol/L Mg(2+)可以使液化效果恢復(fù)至正常水平，并降低酒精發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)呛俊?/p>

關(guān)鍵詞酒精發(fā)酵；蒸餾廢液；金屬離子；耐高溫ɑ-淀粉酶；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)

隨著人們對能源需求的日益增加，燃料乙醇作為一種綠色可再生能源逐漸引起世界各國的關(guān)注[1]。木薯作為一種非糧作物，具有淀粉含量高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢[2]，被認為是酒精生產(chǎn)的理想原料。但是酒精發(fā)酵每生產(chǎn)1 t乙醇就會產(chǎn)生7～15 t的廢水[3]，這類廢水COD高達60 000～100 000 mg/L，pH一般在3.8～4.5，是乙醇生產(chǎn)的主要污染源。

大多數(shù)的蒸餾廢液綜合處理方式都采用將一部分的蒸餾廢液返還生產(chǎn)中用于拌料[4]，在減少蒸餾廢液污染的同時，還可以減少工藝用水。但是大量實踐證明隨著蒸餾廢液回用比例和批次的增加，酒精發(fā)酵殘?zhí)窃黾樱贫冉档停蚩赡苁钦麴s廢液中的某些物質(zhì)會對酒精發(fā)酵產(chǎn)生抑制作用[5]。

本文在對蒸餾廢液回用時，酒精發(fā)酵結(jié)束后殘?zhí)巧咴蚍治龅幕A(chǔ)上，考察了蒸餾廢液中的金屬離子對木薯淀粉液化過程的影響。詳細考察了不同濃度條件下，金屬離子對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活及二級結(jié)構(gòu)的影響，并提出了解決方案。

1材料與方法

1.1原輔料與菌種

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)：湖北宜昌安琪酵母有限公司。

木薯：河南天冠企業(yè)集團有限公司。

酶：耐高溫ɑ-淀粉酶(100 000 U/mL)和糖化酶(10 000 U/mL)，均由無錫杰能科生物工程有限公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1酒精發(fā)酵種子培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06，pH自然，115 ℃滅菌15 min。培養(yǎng)條件：搖床培養(yǎng)，200 r/min，30 ℃，18 h。

1.2.2液化液制備與酒精發(fā)酵

按1∶2.5(g∶mL)的比例將木薯粉(平均粒徑0.45 mm)與配料水混合，用硫酸或氫氧化鈉溶液將料液pH調(diào)節(jié)至5.5，加入耐高溫α-淀粉酶(15 U/g木薯粉)。加熱料液至100 ℃，維持30 min。降溫至室溫，添加去離子水以彌補液化過程水分的損失。分裝至250 mL三角瓶中，滅菌(115 ℃，20 min)。降溫后加入糖化酶(150 U/g木薯粉)、種子培養(yǎng)基(10%,v/v)和尿素(450 mg/L)啟動酒精發(fā)酵。在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵48 h。

1.2.3分析方法

還原糖測定：菲林試劑滴定法[6]。

耐高溫ɑ-淀粉酶酶活測定：DNS顯色法[7]。

耐高溫ɑ-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)測定：圓二色譜檢測(MOS-450多功能圓二色譜儀法國Bio-Logic公司)。檢測條件：樣品濃度0.22 mmol/L，樣品池厚度0.1 cm，波長范圍190～250 nm，掃描速度30 nm/min，掃描次數(shù)3次。用CD分析軟件Dichroweb計算耐高溫ɑ-淀粉酶中四種二級結(jié)構(gòu)的百分含量[8]。

金屬離子測定：火焰原子吸收光譜法。

總糖測定：料液與4% HCl按1∶9比例混勻，沸水浴2 h，冷卻后，中和至中性或弱酸性，按還原糖測定方法進行檢測。

酒度：HPLC法，蒸餾法。

2結(jié)果與討論

2.1不同蒸餾廢液回用比例對酒精發(fā)酵殘?zhí)橇康挠绊?/p>

分別以0%、20%、40%、60%、80%和100%的比例將蒸餾廢液回用于配料，并進行液化、糖化及酒精發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后殘總糖、乙醇濃度如表1所示。隨著蒸餾廢液回用比例的增加，發(fā)酵液中殘?zhí)橇恐饾u增加，酒度略有下降。蒸餾廢液回用造成殘?zhí)橇枯^高的原因可能是：一是木薯淀粉液化不徹底造成較多的淀粉等多糖殘余；二是木薯淀粉液化后糖化不完全，殘余較多的糊精等短鏈糖；三是酵母細胞對葡萄糖的利用不完全導(dǎo)致葡萄糖殘余量較多。實驗中檢測了酒精發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液中殘淀粉、殘糊精和殘還原糖的含量，結(jié)果如圖1所示。

表1　不同蒸餾廢液回用比例對酒精發(fā)酵殘?zhí)橇亢?/p>

圖1　不同蒸餾廢液回用比例對酒精發(fā)酵殘還原糖、殘糊精和殘淀粉含量的影響Fig.1　Effects of different distillery waste recycling ratios on residual reducing sugar, dextrin and starch concentrations

隨著回用比例增加，發(fā)酵液中殘糊精和殘還原糖濃度基本一致，說明蒸餾廢液回用對木薯淀粉糖化過程和酵母發(fā)酵沒有抑制作用；而殘淀粉分別占殘總糖量的65.04%、67.63%、70.20%、69.83%、71.48%和73.73%，說明木薯淀粉液化過程受到抑制是導(dǎo)致殘總糖量較高的主要原因，并且隨著蒸餾廢液回用比例的增加，殘淀粉的量也逐漸增加，說明蒸餾廢液中的某些物質(zhì)對木薯淀粉液化過程具有抑制作用。

2.2蒸餾廢液中金屬離子對耐高溫ɑ-淀粉酶的影響

2.2.1蒸餾廢液中金屬離子濃度的測定

研究發(fā)現(xiàn)，金屬離子會影響耐高溫ɑ-淀粉酶的酶活力[9]。蒸餾廢液中的金屬離子主要來自木薯原料夾帶，以及發(fā)酵液(pH 3.8～4.5)對金屬材質(zhì)罐體和管道的腐蝕。這些金屬離子可能會使耐高溫ɑ-淀粉酶鈍化，從而對木薯淀粉液化過程產(chǎn)生抑制。自來水和蒸餾廢液中主要金屬離子濃度如表2所示。蒸餾廢液中金屬離子主要有Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、Al3+、Li+等，且濃度均高于自來水對照。

表2　自來水和蒸餾廢液中主要金屬離子濃度

注：N.D.指未檢測到。

2.2.2蒸餾廢液中金屬離子對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的影響

分別研究不同金屬離子濃度對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的影響(設(shè)定去離子水中耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力為100%)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同金屬離子對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的影響Fig. 2　Effect of different metal ions on α-amylase activity(注：Na+濃度×20倍，K+濃度×10倍，Mg2+和Li+濃度×2倍)

當(dāng)Na+和K+濃度分別在140 mmol/L和70 mmol/L以內(nèi)時，對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力基本沒有影響，蒸餾廢液中Na+和K+濃度分別為55.89 mmol/L和33.27 mmol/L，對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力沒有影響。Fe3+、Al3+和Li+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力有一定的抑制作用，其中Al3+和Li+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力有輕微的抑制作用，F(xiàn)e3+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的抑制作用最為顯著，當(dāng)Fe3+濃度達到7 mmol/L時，耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力僅有原始酶活力的78.56%。蒸餾廢液中Fe3+濃度是1.40 mmol/L，對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力具有抑制作用。當(dāng)Mg2+濃度在14 mmol/L以內(nèi)時，Mg2+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力具有明顯的促進作用，并且隨著Mg2+濃度的增加，酶活力也逐漸增加。蒸餾廢液中Mg2+濃度是7.24 mmol/L，對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力具有促進作用。隨著Ca2+濃度的增加，耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力呈先升高后下降的趨勢，當(dāng)Ca2+濃度是1 mmol/L時，酶活力最大，隨著Ca2+濃度繼續(xù)增加，酶活力逐漸下降。

2.2.3蒸餾廢液中金屬離子對耐高溫ɑ-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響

表3　不同金屬離子對耐高溫ɑ-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)的影響

注：對照組指不添加金屬離子的原始耐高溫ɑ-淀粉酶。

2.3蒸餾廢液回用木薯淀粉液化過程優(yōu)化

實驗證明，蒸餾廢液中的部分金屬離子對木薯淀粉液化過程具有抑制作用。雖然通過增加耐高溫ɑ-淀粉酶用量、升高液化溫度或者延長液化時間可以改善木薯淀粉的液化效果，但是這些方式會使酒精生產(chǎn)成本增加較大。研究發(fā)現(xiàn)，有些金屬離子會產(chǎn)生拮抗作用，一種離子的抑制作用可以通過添加另一種離子來消除[15]，因此可以通過在蒸餾廢液初次回用時加入對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力具有促進作用的Mg2+，使整個循環(huán)體系中Mg2+濃度增加，消除抑制離子對耐高溫ɑ-淀粉酶的鈍化作用，進而減少發(fā)酵殘?zhí)橇俊?/p>

2.3.1Mg2+和Fe3+對耐高溫ɑ-淀粉酶的共同影響

如圖2所示，蒸餾廢液中的Fe3+是抑制耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的主要因素，而Mg2+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力具有促進作用。因此在酶反應(yīng)體系中分別加入0、2、4、6、8、10和12mmol/L Mg2+與1.4mmol/L Fe3+的混合溶液，檢測耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力以及二級結(jié)構(gòu)的變化。設(shè)定原始酶活力為100%，酶活力變化如圖3所示，酶二級結(jié)構(gòu)變化如表4所示。1.4 mmol/L Fe3+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力具有明顯的抑制作用，酶活力僅有原始酶活力的80.82%。隨著Mg2+濃度的增加，酶活力逐漸升高，當(dāng)Mg2+濃度達到8mmol/L時，酶活力恢復(fù)到最初水平，說明Mg2+可以有效地消除Fe3+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的抑制作用。如表4所示，當(dāng)體系中只有1.4 mmol/L Fe3+時，ɑ-螺旋含量下降了24.4%，耐高溫ɑ-淀粉酶二級結(jié)構(gòu)由有序狀態(tài)向無序狀態(tài)轉(zhuǎn)變；而當(dāng)加入Mg2+后，ɑ-螺旋含量大幅度上升，說明耐高溫ɑ-淀粉酶酶能夠競爭性的與Mg2+結(jié)合，使酶活力得到恢復(fù)。

圖3　Mg2+和Fe3+對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的共同影響Fig. 3　Synergetic effect of Mg2+ and Fe3+ on α-amylase activity

Fe3+/(mmol·L-1)Mg2+/(mmol·L-1)ɑ-螺旋/%β-折疊/%β-轉(zhuǎn)角/%無規(guī)則卷曲/%0034.711.423.531.81.4010.3441033.61.4256.9319.220.91.4456.73.619.320.51.46573.219.221.11.4856.63.619.320.61.410583.619.319.61.41266.68.511.613.5

2.3.2Mg2+對木薯淀粉液化效果影響

以蒸餾廢液作為拌料水，并在蒸餾廢液中分別加入0、4、8、12和16 mmol/L Mg2+，按料水比為1∶2.5進行拌料，之后進行液化。液化過程還原糖生成量如表5所示。隨著蒸餾廢液中Mg2+濃度的增加，木薯淀粉液化過程還原糖生成量也逐漸增加，當(dāng)Mg2+濃度達到16 mmol/L時，木薯淀粉液化過程還原糖生成量達到自來水液化水平，說明在回用蒸餾廢液中加入Mg2+可以改善木薯淀粉的液化效果。

表5　Mg2+對木薯淀粉液化過程還原糖生成量的影響

2.3.3Mg2+對不同比例蒸餾廢液回用酒精發(fā)酵殘?zhí)橇康挠绊?/p>

如表5所示，在回用蒸餾廢液中加入16 mmo/L Mg2+，木薯淀粉液化效果與自來水拌料木薯淀粉液化水平相當(dāng)，因此分別以0%，20%，40%，60%，80%和100%加入16 mmo/L Mg2+的回用蒸餾廢液作為拌料水進行酒精發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果如圖4和表6所示。

圖4　蒸餾廢液不同比例回用時，Mg2+(16mmol/L)添加對酒精發(fā)酵結(jié)束后殘還原糖、殘糊精和殘淀粉量的影響Fig. 4　Effects of different distillery waste recycling ratios with 16 mmol/L Mg2+ on residual reducing sugar,dextrin and starch concentrations

回用比例/%020406080100乙醇/%13.7513.8613.9614.0513.9413.85

隨著蒸餾廢液回用比例的增加，殘還原糖、殘糊精和殘淀粉的量基本不變，與圖1相比，殘還原糖和殘糊精的量沒有變化，而殘淀粉和殘總糖的量明顯降低，說明在回用蒸餾廢液中加入16 mmol/L Mg2+能夠有效地減少酒精發(fā)酵的殘?zhí)橇俊Ｈ绫?所示，隨著蒸餾廢液回用比例增加，酒精發(fā)酵乙醇生成量有一定幅度的上升，當(dāng)蒸餾廢液回用比例超過60%時，與低回用比例相比乙醇生成量雖有所下降但仍略高于自來水配料的酒精發(fā)酵，這可能與蒸餾廢液低比例回用，一定濃度的乙酸、丙酸等小分子有機酸可以減少酒精發(fā)酵過程中甘油等副產(chǎn)物的合成有關(guān)。Taherzadeh等人的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在酒精發(fā)酵體系中加入乙酸時，乙醇的產(chǎn)量增加，生物質(zhì)和甘油產(chǎn)量會下降[16]；張成明等人的研究發(fā)現(xiàn)，丙酸可以減少酒精發(fā)酵甘油的產(chǎn)量[17]，說明如果殘余淀粉能夠得到充分利用，一定比例蒸餾廢液回用能夠提高酒精發(fā)酵的乙醇生成量。

3結(jié)論

蒸餾廢液回用于酒精發(fā)酵過程可減少廢水排放和水資源消耗，但是蒸餾廢液的回用會造成發(fā)酵殘?zhí)瞧毡樯撸M而降低原料利用率和增加生產(chǎn)成本。液化過程中耐高溫α-淀粉酶受到蒸餾廢液中金屬離子的抑制是造成該問題的主要原因。研究證明，蒸餾廢液中Fe3+是抑制耐高溫α-淀粉酶活力的主要物質(zhì)；另一方面，Mg2+能夠提高耐高溫α-淀粉酶活力。在蒸餾廢液中添加Mg2+可以有效消除Fe3+等對耐高溫ɑ-淀粉酶酶活力的抑制作用。當(dāng)Mg2+濃度為16mmol/L時，液化過程還原糖生成量恢復(fù)至自來水配料時的液化水平，酒精發(fā)酵醪中殘?zhí)橇拷档停掖忌闪吭黾印?/p>

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Effect of metal ion in distillery waste on cassava starch lique faction and its optimization

YANG Sheng-qian，ZHANG Jian-hua，MAO Zhong-gui*，WANG Ke

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

ABSTRACTRecycling distillery waste in ethanol fermentation can effectively reduce discharge of waste water. However this results in increased residual sugar concentration. It has been found that inhibition of the liquefaction process by distillery waste caused the increased residual sugar concentration. Effects of metal ions in the distillery waste on the activity and secondary structure of α-amylase were studied herein. Results showed that 55.89 mmol/L Na+ and 33.27mmol/L K+ had no effect on the α-amylase activity. 3.85 mmol/L Al(3+) and 0.98 mmol/L Li+ had a slight inhibition on α-amylase activity. 7.24 mmol/L Mg(2+) and 3.87mmol/L Ca(2+) could stimulate the α-amylase activity. α-amylase was mainly inhibited by Fe(3+) and the enzyme activity was reduced by 19.18% with 1.4mmol/L Fe(3+). α-helical decrease caused by Fe(3+) maybe resulted in inhibition of ɑ-amylase activity. Meanwhile, addition of 16 mmol/L Mg(2+) to the distillery waste could promote the liquefaction of starch and decrease the residual sugar concentration.

Key wordsethanol fermentation；distillery waste；recycling；metal ion；ɑ-amylase；secondary structure

收稿日期：2015-09-14，改回日期：2015-10-15

基金項目：蘇州市科技支撐計劃(SS201412)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602010

第一作者：碩士研究生(毛貴忠教授為通訊作者,E-mail:maozg@vip.163.com)。