初始溶氧含量對功率超聲波觸發過氧化氫酶溶液初始成核的影響

張三強，周新麗，戴澄，楊云

(上海理工大學 食品科學與技術研究所，上海，200093)

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初始溶氧含量對功率超聲波觸發過氧化氫酶溶液初始成核的影響

張三強，周新麗*，戴澄，楊云

(上海理工大學 食品科學與技術研究所，上海，200093)

摘要控制成核在食品結晶、冷凍冷藏、冷凍干燥、冷凍濃縮方面有著重要的意義，功率超聲波是一種有效觸發溶液初始成核的方法。該研究用平板接觸超聲法對不同溶氧濃度的過氧化氫酶(Catalase,CAT)溶液進行了超聲觸發初始成核，分析初始溶氧含量對CAT溶液超聲觸發成核溫度、延遲時間的影響，并對兩種高溶氧含量下CAT溶液超聲觸發成核形成的冰晶大小和分布進行了分析。結果顯示，CAT溶液溶氧含量越高，超聲觸發成核所獲得的最大成核溫度越高，成核溫度控制更準確，延遲時間更短。此外，溶氧含量高的溶液在相同觸發溫度下其平均冰晶尺寸小。

關鍵詞功率超聲波；溶氧含量；初始成核；冰晶大小

冷凍是一種廣泛應用于保存食品感官屬性和營養價值的方法[1]。其實質是水在過冷溫度下轉變為冰，這個過程決定了形成冰的形態、大小、分布，也決定了與冷凍相關過程(如冷凍干燥、冷凍濃縮)的有效性和冷凍食品的最終品質[2-3]。在食品冷凍保藏中需要小冰晶的生成利于食品組織的保存，但在冷凍干燥和冷凍濃縮過程中希望大冰晶的生成以提高加工效率[4-5]。而成核過程是一種隨機自發的過程，形成的冰晶大小具有隨機分布的特點。因此控制成核對食品冷凍及相關過程具有重要作用，目前一些新技術包括高壓冷凍、超聲輔助凍結、射頻輔助凍結等用于控制成核過程[6～8]。

功率超聲波是一種低頻率(20～100 kHz)高能量輸出的超聲波[9]。自1964年CHALMERS[10]首次發現超聲作用可以促進純水的初始成核以來，功率超聲技術在食品冷凍中的各個方面的應用已經被報道，包括初始成核、控制冰晶體的尺寸、加快凍結速率以及改善冷凍食品的品質[11-15]。NAKAGAWA[16]等發現超聲在較高溫度下觸發溶液成核可以獲得較大的冰晶，利用此性質提高了冷凍干燥的干燥速率。此外，研究發現影響超聲控制成核的因素包括輻照溫度、超聲強度、處理時間[17]，低溫度下有利于超聲觸發成核，由于超聲波熱效應的存在，觸發成核需要適宜的超聲強度和處理時間。

除了以上對超聲輔助冷凍有重要影響的因素外，溶液中氣體含量對超聲觸發成核的影響也應當給予充分重視。ZHANG[19]等發現含有大量氣泡的溶液控制成核的重復性要比低氣泡含量要好。JABBARI-HICHRI[20]等研究發現，在相同的超聲強度下，含氣量高的溶液獲得較為均勻的冰晶。由此可見，溶液中存在溶解的氣體能夠改善超聲觸發成核的效果。目前，氣體對控制成核影響的研究主要在于氣泡尺寸大小以及氣泡含量上，關于溶解氣體含量對液態食品中超聲控制成核影響的研究還比較少，其影響規律還需要更多的機理分析和實驗驗證。

過氧化氫酶(Catalase,CAT)是一種廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，它是生物體內重要的參與活性氧代謝過程的物質[21]。用其作為模式蛋白模擬液態活性食品功率超聲波控制成核，可以根據其活性的變化推測液態活性食品在控制成核過程中的變化[22]。本研究以CAT溶液為研究對象，自行搭建平板超聲輔助凍結裝置，通過控制冷凍樣品初始溶解氧含量，進行超聲觸發成核實驗，探討溶氧含量對超聲觸發成核溫度以及成核有效性的影響，同時對高溶氧含量CAT溶液超聲觸發成核形成冰晶尺寸進行分析，期望為需要超聲控制成核的液態食品的冷凍保存、冷凍干燥及冷凍濃縮過程優化提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

過氧化氫酶(牛肝，Sigma)、蔗糖(AR，滬試)、磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4，sigma)、超純水、7 mL西林瓶、溶液過濾器(0.22 μm)。

1.2儀器與設備

超聲波發生器、不銹鋼平板(200 mm×200 mm×1.5 mm)、喇叭形超聲振子、冷凍干燥機、數據采集儀、T型熱電偶、計時器、AZ-8402便攜式溶氧儀、金相體式顯微鏡、冷凍切片機等。

實驗裝置如圖1所示。超聲波輔助凍結系統由超聲波發生器(29 kHz)、兩個超聲振子(60 W)、不銹鋼平板組成。用鋁箔法確定超聲波系統中空化作用強烈的區域，然后在此區域增加一個緊固西林瓶的擋板，實驗時將西林瓶置于兩個擋板中間，為了防止西林瓶在超聲振動時滑動、跳起。溫度檢測系統由T型熱電偶、安捷倫數據采集儀和計算機組成。實驗時將超聲波輔助凍結系統直接置于凍干機擱板(作為制冷系統)上固定位置處。

圖1　超聲輔助凍結裝置Fig.1　 Ultrasonic assisted freezing device

1.3實驗方法

1.3.1溶液制備

本研究選取過氧化氫酶作為模式蛋白，配制1 mg/mL 的CAT溶液于磷酸鹽緩沖液中(pH 7.2～7.4)，冷凍保護劑選擇質量分數10%的蔗糖溶液。CAT溶液配制好后用0.22 μm孔徑的過濾器過濾。用移液槍吸取3 mL CAT溶液移入7 mL的西林瓶中，瓶中溶液厚度為8 mm。

將AZ-8402便攜式溶氧儀的傳感器放置在CAT溶液的幾何中心位置處，測定CAT溶液的溶氧含量，五種溶氧濃度水平的溶液通過以下方法獲取：

(1)低溶氧水平：溶氧含量為3.98 mg/L，將配制好的CAT溶液置于凍干機真空室中，控制真空室壓力為10 kPa、擱板溫度設置為4 ℃(防止酶過度失活)，進行真空脫氣8 h；

(2)較低溶氧水平：溶氧含量為6.23 mg/L，將配制好的CAT溶液置于凍干機真空室中，控制真空室壓力為10 kPa、擱板溫度設置為4℃，進行真空脫氣4 h；

(3)平衡溶氧水平：溶氧含量為8.20 mg/L，將配制好的CAT溶液直接密封后放入4 ℃冰箱中降溫待用。

(4)較高溶氧水平：溶氧含量為10.15 mg/L，將配制好的CAT溶液直接密封后放入4 ℃冰箱中降溫至4 ℃后，實驗前直接注入壓縮空氣。

(5)高溶氧水平：溶氧含量為13.44 mg/L，將配制好的CAT溶液直接注入壓縮空氣，用液氮快速冷卻但不要凍結。

1.3.2實際聲場強度測定方法

超聲強度是描述超聲換能器產生能量的度量，多種因素諸如：容器的尺寸和幾何形狀、傳播介質的特性、阻抗匹配等都對超聲強度產生影響。在測量實際超聲聲學特性的方法中，量熱法是最簡單、可靠的方法[13]：用T型熱電偶記錄連續施加10 min超聲3 mL純水溫度的變化。

超聲消散在純水中的實際功率：

(1)

實際消散在純水中的超聲強度IA(W/cm2)：

(2)

1.3.3超聲觸發成核的方法

首先將超聲波平板放置于凍干機擱板上，開啟凍干機，控制凍干機冷腔和超聲平板溫度至4 ℃后，用移液槍將控制好溶氧濃度的CAT溶液移取3 mL置7 mL的西林瓶中，將西林瓶放置于兩個擋板中間，將熱電偶插入溶液幾何中心位置處。關閉冷腔艙門，設置擱板溫度為-35 ℃，讓擱板與不銹鋼平板從4 ℃開始降溫。開啟溫度采集系統采集溫度，數據采集儀每隔1 s采集1次溫度。當溶液溫度降至-1 ℃時開啟超聲輻照5 s，若未見成核現象，溫度每降低0.5 ℃施加5 s超聲波。預實驗已經表明施加5 s超聲波輻照不會引起溶液溫度大幅升高。溶液成核后移去超聲輔助凍結平板繼續冷凍至-35 ℃。根據溫度采集儀采集到的凍結曲線讀取成核溫度和延遲時間。

1.3.4冰晶大小的觀察與計算方法

凍結后的CAT溶液繼續凍結3 h后，打碎西林瓶取出冰塊，在冷凍切片機-30 ℃下切片，在凍結溶液橫向切出一個平滑的平面，立即放入低溫槽中(-30 ℃)，于配有CCD的金相體視顯微鏡下進行顯微觀察與拍照，冰晶照片用 Image Pro Plus軟件計算冰晶大小，本實驗中采用蔗糖作為冷凍保護劑，蔗糖溶液能夠生長成大的枝狀冰晶，因此冰晶大小采用冰晶長度作為度量。

1.4數據處理與分析

每組實驗重復3次進行數據處理與分析，采用Origin9.0軟件和SPSS 13.0軟件進行數據分析。

2結果與分析

2.1溶氧含量對超聲觸發最高成核溫度的影響

經測定超聲裝置的實際聲強為0.261 W/cm2，當溶液溫度降至-1 ℃時開啟超聲輻照5 s，若未見成核現象，溫度每降低0.5 ℃施加5 s超聲波。圖2為不同溶氧含量的CAT溶液在不施加超聲以及施加超聲時的成核溫度。

圖2　溶氧含量對CAT溶液自發成核、觸發成核溫度的影響 Fig.2　Effect of dissolved oxygen content on spontaneous nucleation and trigger nucleation temperature of the CAT solution

由圖2可以看出，不施加超聲時溶氧含量為3.98，6.23，8.20，10.15，13.44 mg/L的溶液的成核溫度都很低，分別為-12.30±1.90 ℃、-12.38±2.17 ℃、-12.51±2.38 ℃、-13.90±2.26 ℃、-14.30±2.34 ℃，并且隨機發生在一定溫度范圍內偏差較大。說明溶液中不同的氣體含量本身并不能提高溶液的成核溫度以及改變成核的隨機性。但是在施加超聲后，溶氧含量為3.98，6.23，8.20，10.15，13.44 mg/L的溶液的最高成核溫度分別為-10.47±0.14，-9.54±0.09，-8.13±0.15，-4.01±0.12，-1.29±0.11 ℃，由于超聲對成核的控制作用，不同溶氧含量的CAT溶液的成核溫度都明顯提高并且溫度偏差很小。值得關注的是，隨著溶氧含量的增加，溶液最大成核溫度顯著增加。溶液充氣后最大成核溫度比未充氣對照組溶液(8.20 mg/L)明顯提高了4.27 ℃(10.15 mg/L)和6.84 ℃(13.44 mg/L)；當溶液脫氣后最大成核溫度比未充氣對照組溶液(8.20 mg/L)降低了1.41 ℃(6.23 mg/L)和2.34 ℃(3.98 mg/L)。說明在超聲的作用下，溶液的氣體含量對溶液的成核溫度的影響變得非常顯著。一般認為超聲在過冷水中作用形成的空化氣泡是促進冰晶生成的重要原因，溶液充氣后溶液中會存在大量溶解氣體和氣泡，超聲作用時會形成大量空化氣泡，促進冰晶形成，因而充氣溶液能在較高成核溫度(低過冷度)下能成核。利用溶氧含量高的溶液可以在較寬的過冷范圍內控制成核的性質，將給成核過程帶來更多的選擇性，既可以在較高成核溫度下控制成核加快冷凍干燥速率以及冷凍濃縮濃縮率，又可以在低成核溫度下控制成核改善冷凍保存食品的品質。

2.2溶氧含量對超聲觸發成核有效性的影響

為研究不同溶氧水平下超聲控制成核的有效性，對充氣后兩種溶液和未充氣對照組進行超聲控制成核實驗，測量其超聲觸發及溶液成核的延遲時間和溫度差。

圖3為不同觸發溫度下兩種充氣溶液與未充氣對照組(8.20 mg/L)超聲控制成核的延遲時間。從中可以看出在相近的觸發溫度范圍內(-7～-9 ℃)兩種充氣溶液的延遲時間(10.15 mg/L：0.7～1.3 s；13.44 mg/L：0.7～1 s)要比對照組溶液的延遲時間(2.3～3.3 s)短。比較兩種充氣溶液之間在較高觸發溫度下(-6～-1 ℃)超聲觸發與溶液成核之間的延遲時間也存在差異，其中在相同觸發溫度下(-5 ℃)高溶氧含量(13.44 mg/L)1.3 s的延遲時間要比較高溶氧含量(10.15 mg/L)2.7 s的延遲時間明顯縮短，溶液含有高溶氧含量縮短了超聲空化泡生長、振蕩及崩潰這個過程的時間，因而其觸發成核延遲時間縮短。

圖3　不同超聲觸發溫度下控制成核的延遲時間Fig.3　Delay time of controlling nucleation at different ultrasonic trigger temperatures

圖4為兩種充氣CAT溶液與未充氣對照組(8.20 mg/L)超聲觸發溫度與成核溫度之間溫差。可以看出發現在相近的觸發溫度范圍內(-7～-9 ℃)兩種充氣溶液的溫差(10.15 mg/L：0.1～0.21 ℃；13.44 mg/L：0.11～0.13 ℃)明顯小于未充氣對照組溶液的溫差(0.22～0.35 ℃)。并且兩種充氣溶液之間在較高觸發溫度下(-6～-1 ℃)超聲觸發與溶液成核溫差也存在差異，比較兩種充氣溶液在相同成核溫度-5 ℃下，高溶氧含量(13.44 mg/L)CAT溶液超聲觸發成核溫差為0.14 ℃明顯小于較高溶氧含量下(10.15 mg/L)的溫差0.56 ℃。根據圖3充氣溶液具有更短的成核延遲時間，因而溫差較小，另一方面超聲作用時的熱效應也可導致高溶氧含量下更小的成核溫差出現。

圖4　不同超聲觸發溫度下觸發溫度與成核溫度的溫差Fig.4　Differences between trigger temperature and nucleation temperature at different ultrasonic trigger temperatures

由此可見溶液充氣后可以提高溶液超聲控制成核的有效性，其延遲時間更短，溫度控制更準確，可以向液體食品中充入氣體的方法來改善超聲的控制成核。

2.3溶氧含量對冰晶大小的影響

對溶氧含量為10.15 mg/L的CAT溶液在-4，-5，-6，-7，-9 ℃超聲觸發成核；溶氧含量為13.44 mg/L的CAT溶液在-1，-3，-5，-7，-9 ℃超聲觸發成核，測定其形成的冰晶大小。

圖5為兩種充氣溶液及無超聲對照組超聲觸發成核凍結后形成冰晶的平均大小。可以看出兩種充氣溶液超聲觸發成核后均可以提高形成冰晶的平均大小。在相同的觸發溫度下高溶氧水平(13.44 mg/L)溶液觸發成核形成的冰晶平均大小要比較高溶氧水平(10.15 mg/L)溶液形成的冰晶平均大小要小18.82～31.90 μm，可見溶液中的初始含氣量對超聲觸發成核形成的平均冰晶大小有顯著影響。

圖5　高溶氧CAT溶液超聲觸發溫度和平均冰晶大小的關系Fig.5　Relationship between the trigger temperature and the average size of ice crystals in dissolved oxygen content of CAT solution

結合圖6中兩種充氣溶液在-7 ℃觸發溫度下形成冰晶大小累積分布頻率圖中可以看出，13.44 mg/L高溶氧水平的溶液在較小冰晶(<237.27 μm)分布的頻率較高，而10.15 mg/L較高溶氧水平的溶液在較大冰晶(>237.27 μm)的分布頻率較高。這也印證了前面的分析，溶液充氣后含有高的氣體含量增加了超聲空化泡的形成，同時高氣體含量也加快了空化周期內空化泡的膨脹和崩潰[23]，這些增加的空化泡促進了更多的晶核產生，使得相同體積的溶液最終形成的冰晶體數目增加而平均冰晶大小減小。此外，兩種充氣溶液在此觸發溫度下形成的冰晶均比無超聲對照組要大，因而兩種溶氧條件下進行超聲觸發成核都可獲得較大冰晶。因此在利用充氣法作為提高超聲觸發成核效率的同時也要考慮溶液中氣體含量對形成冰晶大小分布的影響，這對于需超聲控制冰晶大小的冷凍干燥和冷凍濃縮來說非常重要。

圖6　不同觸發溫度下冰晶大小的累積分布頻率圖Fig.6　The cumulative distribution frequency of ice crystal size at different trigger temperature

3結論

本文研究了CAT溶液中初始溶氧含量對超聲觸發成核的影響，結果顯示CAT溶液溶氧含量越高，超聲觸發成核所獲得的最大成核溫度越高，高溶氧含量溶液可以在較寬的過冷范圍內控制成核。增加溶氧含量可以提高超聲觸發成核的有效性，其溫度控制更準確，延遲時間更短。此外，高溶氧水平的溶液在超聲觸發成核后產生的冰晶平均尺寸較小，在較小冰晶分布的頻率較高。以上結論為需要超聲控制成核的液態食品的冷凍保存、冷凍干燥及冷凍濃縮過程優化提供參考。

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Influence of initial oxygen content on initial nucleation of Catalase solution triggered by power ultrasound

ZHANG San-qiang, ZHOU Xin-li*, DAI Cheng, YANG Yun

(University of Shanghai for Science and Technology, Institute of Food Science and Technology, Shanghai 200093, China)

ABSTRACTControl nucleation is of great significance in crystallization, freezing, freeze-drying and freeze-concentration. Power ultrasound is an effective method to trigger initial nucleation of solution. The flat contact ultrasonic method was used to trigger the initial nucleation of different dissolved oxygen concentration of Catalase solution. The influence of initial oxygen in CAT solution on ultrasound triggered nucleation temperature and delay time were analyzed. Meanwhile, the size and distribution of ice crystals prepared with two kinds of high dissolved oxygen concentration of Catalase solution were analyzed. The results showed that the higher dissolved oxygen concentration of Catalase solution, the higher nuclear temperature obtained by ultrasonic triggered. High dissolved oxygen solution can form nucleus at low degree of supercooling with accurate temperature control and shorter delay time. And also the ice crystals of high dissolved oxygen content solution were relatively smaller at the same trigger temperature.

Key wordspower ultrasound; oxygen content; initial nucleation; ice crystal size

收稿日期：2015-08-13，改回日期：2015-10-27

基金項目：國家自然科學基金(51376132)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602009

第一作者：碩士研究生(周新麗為通訊作者，E-mail:zjulily@163.com)。