Paenibacillus spp. BD3526發酵小麥麩皮生產凝乳酶

杭鋒，洪青，陶源，王欽博，劉振民，陳衛*

1(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫, 214122)　2(乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海，200436)

?

Paenibacillusspp. BD3526發酵小麥麩皮生產凝乳酶

杭鋒1,2，洪青2，陶源1，王欽博2，劉振民2，陳衛1*

1(江南大學 食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫, 214122)2(乳業生物技術國家重點實驗室，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海，200436)

摘要對Paenibacillus spp. BD3526凝乳酶的發酵條件和凝乳性能進行了研究，探討了不同培養基、發酵時間、碳源、氮源和裝液量對凝乳酶活力和活菌數的影響，并與商業化的小牛皺胃酶、重組凝乳酶、Rhizomucor miehei來源凝乳酶進行凝乳性能比較。實驗結果表明：發酵時間、碳源、氮源和裝液量對BD3526凝乳酶活力(milk-clotting activity, MCA)和蛋白水解活力(proteolytic activity, PA)均有不同程度的影響。選用小麥麩皮培養基進行發酵至24 h時，MCA達到最大至3 279.76±67.11 SU/mL，凝乳性能強，PA值在整個發酵期間變化不大；添加碳源或氮源會不同程度地降低MCA值；裝液量為30 mL時，發酵上清液中菌體濃度最高、MCA達到6 000 SU/mL。與商業化的凝乳酶相比，BD3256凝乳酶在凝乳過程中未使凝乳塊產生過度水解，也無乳清析出現象，具有應用到干酪生產中的潛力。

關鍵詞Paenibacillus spp.；凝乳酶；小麥麩皮；凝乳酶活力；蛋白酶活力

凝乳酶(milk-clotting enzyme, MCE)是制作干酪時凝固牛乳用的酶制劑，通過水解κ-酪蛋白中的Phe105-Met106肽鍵導致牛乳凝結[1]。傳統干酪加工中使用的凝乳酶是小牛皺胃酶，具有高凝乳酶活性與低蛋白水解活力的特性[2]。隨著世界干酪產業規模的不斷擴大，小牛皺胃酶的供應量已無法滿足干酪生產的需求。為此，國內外學者在動物、植物、基因工程及微生物四大方面進行了大量研究，以尋找小牛皺胃酶的替代物。

微生物來源凝乳酶因生產成本低，具有更加廣泛的生化多樣性以及簡便的基因改造方法，被認為最有可能成為小牛皺胃酶替代物。目前研究發現，產凝乳酶的微生物以真菌為主，如Rhizomucorspp.、Mucorspp.、Aspergillusspp.等，同時部分Bacillusspp.等細菌也能夠產凝乳酶[3-6]。然而，微生物凝乳酶通常具有較高的蛋白水解能力(proteolytic activity, PA)，導致蛋白質降解并轉化為乳清，對干酪得率具有負面作用，因此只有部分適于干酪生產[7]。如嗜熱菌Rhizomucormiehei產生的MCE的MCA/PA比值較小牛皺胃酶低，但PA和耐熱性較小牛皺胃酶強，導致了干酪得率降低，55 ℃熱處理30 min殘存PA達95%，成熟過程中對酪蛋白進行非特異性水解，造成干酪苦味形成及質構缺陷；隨乳清排除的MCE對乳清蛋白也存在過度水解現象，降低了經濟利用價值。但也有研究發現，純化的真菌MCE與小牛凝乳酶混合物較單獨的小牛凝乳酶在干酪成熟和風味形成具有優勢。

目前，有關類芽孢桿菌(Paenibacillusspp.)產凝乳酶的研究報道較少，本文從西藏羌塘草原牧民牦牛乳中分離出1株Paenibacillusspp.BD3526，對其發酵小麥麩皮產凝乳酶的影響因素、凝乳活力、蛋白水解活力進行研究，同時與商業化的小牛皺胃酶、重組凝乳酶、R.miehei來源凝乳酶的凝乳性能進行了比較，為該菌所產凝乳酶在干酪生產中的應用奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器

1.1.1菌株

Paenibacillusspp. BD3526(CGMCC No.8333=DSM No.28815)從西藏羌塘草原牦牛乳中分離。

1.1.2實驗材料

小麥麩皮(蛋白質18.6%，脂肪6.2%，總碳水化合物63.9%，水分7.89%，灰分3.38%)，購于農貿市場；脫脂乳粉(脂肪33.4%，脂肪0.8%，乳糖54.1%，礦物質7.9%，水分3.8%)，新西蘭恒天然公司；干酪素，化學純，國藥集團化學有限公司；福林酚試劑，國藥集團化學試劑有限公司；小牛皺胃酶，阿敏生物；R.miehei來源凝乳酶Marzyme?150 MG，杜邦丹尼斯克；Aspergillusnigervar.awamori重組凝乳酶Chy-Max?，Chris Hansen；其他試劑均為分析純。

1.1.3培養基

脫脂乳培養基：配置100 g/L的脫脂乳溶液，經充分溶解和水化后，于118 ℃滅菌15 min。

脫脂乳瓊脂培養基：150 g/L脫脂乳和1.67 g/L瓊脂溶液118 ℃各自滅菌15 min，冷卻至45 ℃后，脫脂乳和瓊脂溶液按1∶9的體積比無菌混勻并傾注平板。

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0。

TYC液體培養基(g/L)：酪蛋白胨15，蔗糖50，酵母膏5.0，L-胱氨酸0.2，乙酸鈉20，Na2SO40.1，NaCl 1.0，Na2HPO4·12H2O 2.0，NaHCO32.0，pH7.3。

30 g/L麩皮培養基：稱取1.5 g小麥麩皮至250 mL三角瓶中并加入50 mL去離子水(不同裝液量條件下小麥麩皮質量按比例稱取)，121 ℃，滅菌20 min后配用。

1.1.4主要儀器

XB.K.25血球計數板，上海求精生化試劑儀器有限公司；HZQ-X500C搖床，上海一恒科學儀器有限公司；恒溫水浴槽，英國Grant公司；Olympus BX60顯微鏡，日本Olympus公司；Specord 205分光光度計，德國耶拿公司；Sorvall Stratos臺式高速冷凍離心機，美國Thermo公司。

1.2實驗方法

1.2.1Paenibacillusspp. BD3526的保存與活化

Paenibacillusspp. BD3526原始菌株已提交中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.8333)和德國微生物菌種保藏中心保藏(DSM No.28815)，實驗室采用凍干脫脂乳管保存于-80 ℃；原始菌株使用前采用脫脂乳培養基活化2次，BD3526接種于脫脂乳中30 ℃、180 r/min搖床培養20 h作為種子液備用。

1.2.2Paenibacillusspp. BD3526培養方法

配置30 g/L的小麥麩皮為產酶培養基，250 mL三角瓶裝樣分別為20、30、40、50和60 mL，接種體積分數3%的種子液，30 ℃、180 r/min條件培養48 h，分別測定0、3、6、9、12、15、18、24、36和48 h發酵液中活菌數、發酵上清凝乳酶活力和蛋白酶活力。

1.2.3碳源和氮源對凝乳酶活力的影響

以30 g/L的小麥麩皮為基礎培養基，分別添加5 g/L的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽糊精和可溶性淀粉；分別添加3 g/L的胰蛋白胨、酵母抽提物、酪蛋白水解物、酪蛋白胨、豆粕、尿素、玉米漿、糖蜜、(NH4)2SO4、KNO3，并以未添加碳源的麩皮培養基作為對照。250 mL三角瓶裝樣50 mL，接種量為3%，30 ℃、180 r/min條件培養24 h，測定發酵上清MCA。

1.2.4凝乳酶活力的測定

采用Arima方法進行凝乳酶活力測定[8]。配置100 g/L含有0.01 mol/L的CaCl2脫脂乳，充分水化后用1 mol/L的HCl調節至pH 6.0。取10 mL脫脂乳溶液于試管中并在35 ℃水浴中孵育10 min，將0.5 mL未稀釋或采用0.05 mol/L、pH 6.0的PBS稀釋一定倍數的發酵上清加入至35 ℃的脫脂乳中，每15 s將樣品取出并傾斜45°觀察樣品組織狀態，以形成不連續顆粒的時間計作凝乳時間。1個凝乳酶單位(SU)定義為：35 ℃條件下，使1 mL脫脂乳在40 min發生凝乳所需酶量[9]，并按照公式(1)計算：

(1)

式中：T，凝乳時間，s；VS，底物體積，mL；VE，酶液體積，mL；D，稀釋倍率。

1.2.5蛋白酶活力的測定

以酪蛋白為底物，采用Folin-Ciocalteu phenol方法進行蛋白水解活力測定。將0.5 mL未稀釋或經一定倍數稀釋的發酵上清加至2.5 mL 12 g/L的酪蛋白溶液中(用0.05 mol/L pH 6.0的PBS配置)，混合均勻并在35 ℃水浴10 min后，加入2.5 mL 0.44 mol/L TCA終止反應，于4 ℃、10 000×g離心5 min取上清。取1 mL上清液加入2.5 mL(0.28 mol/L)的NaOH溶液和按1∶1比例稀釋0.75 mL的Folin-Ciocalteu phenol試劑，35 ℃水浴孵育15 min后，測定A660 nm[10]。配置100 μg/mL的酪氨酸溶液，分別測定0，20，40，60，80和100 μg/mL酪氨酸溶液的A660 nm，建立標準曲線。1個蛋白水解活力定義為1 min釋放1 μmol/mL酪氨酸所需的酶量。

1.2.6活菌數的測定

種子液與發酵液中菌體濃度采用血球板計數法進行測定。

1.2.7Paenibacillusspp. BD3526 凝乳酶與商業化凝乳酶的比較

分別將商業化的小牛皺胃酶、重組凝乳酶、R.miehei來源凝乳酶配置成160 SU/mL的酶液，將BD3526發酵上清液稀釋至160 SU/mL，按照方法1.2.4凝乳并將凝乳時間控制在10 min，并在10，20，40，60，90 min觀察其組織狀態。

2結果與分析

2.1BD3526產酶培養基的篩選

以脫脂乳平板法(菌落周圍形成酪蛋白水解圈和沉淀圈)從西藏羌塘草原采集的牦牛乳中篩選得到1株具有產凝乳酶潛質的細菌，經生理生化、細胞脂肪酸組成、G+C含量、同源雜交(數據未公布)和16S rRNA等方法進行鑒定，確定該菌株屬Paenibacillusspp.，命名為Paenibacillusspp. BD3526。其16S rRNA序列已提交GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/758205658，編號：KM978955.1)。

將BD 3526于LB、TYC、100 g/L脫脂乳和30 g/L小麥麩皮培養基中30 ℃、180 r/min培養48 h，上清液中MCA分別為8.30±0.81、9.21±0.75、274.28±3.29和2483.17±68.35 SU/mL。小麥麩皮是微生物發酵生產凝乳酶理想的培養基質，且發酵生產的凝乳酶具有最高的MCA/PA[11,12]，為此，后續實驗過程中均采用小麥麩皮作為產酶培養基。

2.2BD3526凝乳酶的凝乳性能

將種子液(約5×108CFU/mL)按體積分數3%接種至30 g/L的小麥麩皮培養基中，30 ℃、180 r/min培養48 h，發酵上清中的MCA達到2483.17±68.35 SU/mL，具有較高的凝乳酶活力和良好的凝乳特性(圖1)。

圖1　BD 3526于30 g/L小麥麩皮培養基發酵上清凝乳效果Fig.1　Skim milk clotted by the supernant of BD 3526 clutivated in 30 g/L wheat bran broth(注：未添加凝乳酶的脫脂乳為空白對照)

為了進一步評價BD3526凝乳酶在干酪制作中的應用潛力，考察是否存在過度水解的問題，比較了BD3526凝乳酶(發酵上清)與商業化凝乳酶添加至脫脂中10，20，40，60和90 min后凝乳組織狀態(圖2)。

1-小牛皺胃酶；2-重組凝乳酶；3-R.miehei來源凝乳酶；4-BD3526發酵上清液圖2　BD 3526凝乳酶與商業化凝乳酶凝乳效果比較Fig.2　Comparison of the protein hydrolysis between BD3526 milk-clotting enzyme (MCE) and commercial coagulants(注：0.5 mL凝乳酶(160 SU/mL)添加至10 mL 100 g/L脫脂乳中10 min(A)、40 min(B)、60 min(C)和90 min(D)后的凝乳狀態)

不同來源的凝乳酶(160 SU/mL)添加至脫脂乳10 min(圖2，A)和40 min(圖2，B)后，凝乳組織狀態良好，未發生酪蛋白水解和乳清析出的現象；60 min時(圖2，C)，R.miehei和BD3526凝乳酶組的凝乳已發生較為顯著的酪蛋白水解和乳清析出的現象；90 min時(圖2，D)，所有凝乳均發生了酪蛋白水解的現象，R.miehei和BD3526凝乳酶組的酪蛋白水解和乳清析出的程度較小牛皺胃酶和重組凝乳酶組更強一些。為了避免酪蛋白和乳清蛋白發生過度水解，干酪生產過程中凝乳時間一般控制在40 min左右，本實驗中凝乳酶活力較實際生產中提高了4倍，在40 min時BD3526凝乳酶與商業化凝乳酶相比未使凝乳發生過度水解和乳清析出的現象，說明該菌株來源的凝乳酶具有較低的PA。

2.3發酵過程中菌體濃度和酶活變化

為確定BD3526在小麥麩皮培養基中MCA、PA與菌體濃度的關系，在30 ℃、180 r/min搖床發酵條件下，分別測定了其在30 g/L小麥麩皮培養基中培養0，3，6，9，12，15，18，24，36和48 h的發酵液中菌體濃度和發酵上清的MCA、PA(圖3)。發酵上清液中蛋白水解活力采用福林-酚法測定，標準曲線方程為：y=1.700 82x+0.015 90(R2=0.999 49)。

■菌體濃度；●MCA；◆PA圖3　發酵過程中菌體濃度和酶活變化Fig.3　Biomass, MCA and PA during the fermentation

由圖3可見，BD3526接種至麩皮培養基中0～3 h為延滯期，此后進入了生長對數期，15 h后進入穩定期，36 h則進入衰亡期；而發酵上清中的MCA和PA從9 h開始迅速增加，MCA至24 h達到最大值(3 279.76±67.11 SU/mL)，此后呈逐漸下降的趨勢；而PA的變化趨勢亦與MCA相似，但較為穩定，因此，作為凝乳酶重要評價指標之一的MCA/PA則主要由MCA決定，并在24 h達到最大值(表1)。微生物蛋白酶往往由于氮源和碳源的脅迫作用在對數生長后期或穩定期產生[13]，發酵上清從9 h開始具有MCA并在24 h時達到最大，說明BD3526凝乳酶是在對數期生長期后期分泌表達的。

表1　發酵過程中凝乳酶活力和蛋白水解能力的變化

2.4碳源對發酵上清液MCA的影響

不同碳源對發酵上清MCA的影響如圖4所示，添加5 g/L的葡萄糖組、乳糖組和麥芽糖組發酵上清中的MCA顯著低于對照組；蔗糖組、麥芽糊精組和可溶性淀粉組發酵上清中的MCA與對照組無顯著性差異。在補充葡萄糖、乳糖和麥芽糖的發酵上清中的MCA均顯著降低，且各組菌體濃度較對照組低(數據未給出)，酶活高低與菌體濃度有一定的相關性，這可能是由于該菌在補充碳源的情況下不存在碳源脅迫的情況，菌體快速增殖而酶產量降低了，這一現象與M.miehei[14-15]和M.circinelloides[16]在營養物質豐富的條件下，凝乳酶產量降低相似。

Glu-葡萄糖; Lac-乳糖; Suc-蔗糖; Mal-麥芽糖; MD-麥芽糖糊精; SS-可溶性淀粉圖4　碳源對發酵上清液凝乳酶活力的影響Fig.4　Effects of carbon sources on MCA in the supernatants(**-P<0.01)

2.5氮源對發酵上清MCA的影響

不同氮源添加對發酵上清MCA的影響如圖5所示。BD3526在補充氮源的麩皮培養基中發酵上清的MCA活力均顯著低于空白組(P<0.01)，其中，尿素組和KNO3組的發酵上清中的MCA僅為71.14±9.90 SU/mL和41.01±2.11 SU/mL。基于酶學的結構特性，微生物凝乳酶應當在蛋白類物質存在的條件下更利于合成，如足夠蛋白質作為氮源補充可促進A.nigerLBA02在最初48 h發酵過程中MCE產量[12]。然而BD3526在有限的氮源的條件下卻更利于合成微生物凝乳酶，補充無機和有機氮源均會顯著抑制酶產量。該特性與B.subtilisnatto和Mucormiehei在補充無機氮源MCE產量顯著降低的現象類似[10, 17]，但與Mucormiehei選取小麥麩皮、小麥面粉和脫脂乳[17]，Mucorbaciliformis選取小麥麩皮[18]作為有機氮源的條件下MCE產量提高不同。Penicilliumoxalicum[19]和Aspergillusversicolo[10]在添加酵母抽提物和蛋白胨或烘焙酵母作為氮源有利于MCE的合成，而玉米漿和豆粕均不利于P.oxalicumMCE產量的提高；以酪蛋白為補充氮源對T.indicae-seudaticaeN31的凝乳酶產量無影響[11,20]。

通過對生長曲線的比較發現，補充氮源組(除尿素組和KNO3組)的活菌數的增殖速度在對數生長期較空白組略快，但至穩定期時的菌體較空白組低，如24 h空白組菌體濃度為9.25×108CFU/mL，硫酸銨組為7.42×108CFU/mL；KNO3組(3.68×108CFU/mL)和尿素組(2.48×108CFU/mL)的菌體濃度均顯著低于較空白組，可能是硝酸鹽代謝產生的亞硝酸鹽對菌體生產具有抑制作用(BD3526硝酸鹽還原能力為(+))，而脲酶(-)可能導致尿素對菌體生長具有抑制作用。

2.6搖瓶裝液量對菌體濃度和酶活的影響

搖瓶培養中的氧傳遞系數(KLa)隨著裝液量的增加而降低、轉速的提高而增加[21]。為了考察培養基中的溶解氧對菌體增殖和發酵上清中的MCA和PA的影響，將250 mL三角瓶的裝液量由60 mL逐漸降低至20 mL(麩皮培養基濃度為30 g/L)，考察了30 °C和180 r/min的培養24 h后，各組發酵液中菌體濃度以及發酵上清中的MCA和PA(圖6)。

圖6　搖瓶裝液量對菌體濃度和酶活的影響Fig.6　Effect of liquid volume on biomass mass concentration, MCA and PA

由圖6可知，裝液量對24 h發酵液中菌體濃度、MCA和PA均有顯著的影響，其中，30 mL裝液量時，發酵液中的菌體濃度最高(1.10×109CFU/mL)，此時的MCA和PA均具有最高值；隨著裝液量的提高，發酵液中菌體濃度呈逐漸下降的趨勢，MCA和PA也呈下降趨勢，MCA降低則更為顯著：由6 000 SU/mL(裝液量30 mL)降低至3 000 SU/mL(裝液量60 mL)；由此，可以推測裝液量的減少增加了培養基中溶氧水平，促進了BD3526增殖，進而增加了MCA和PA的表達。但裝液量為20 mL時，此時菌體濃度為各組最低(6.0×108CFU/mL)，而此時的MCA和PA僅較30 mL組略低，這可能是此時剪切力較大導致細胞的破裂和胞內目標蛋白酶的釋放所致。

3結論

目前，國內外有關類芽孢桿菌(Paenibacillusspp.)產凝乳酶的研究報道還較少，本研究考察了Paenibacillusspp. BD3526生產凝乳酶的培養介質，對其發酵小麥麩皮產凝乳酶的影響因素(發酵時間、碳氮源和裝液量)、凝乳活力、蛋白水解活力進行研究，同時與商業化小牛皺胃酶、重組凝乳酶、R.miehei來源凝乳酶的凝乳性能進行了比較，結論如下：

(1)Paenibacillusspp. BD3526在不同培養基中產凝乳酶差異顯著，小麥麩皮是該菌株發酵生產凝乳酶理想的培養基質。整個發酵期間，上清中酶活隨發酵時間的延長先上升后下降，在24 h具有最高的MCA，但PA變化不大。

(2)發酵時間和碳、氮源能夠影響BD3526產酶能力，補充碳源或氮源會不同程度的降低MCA。

(3)提高溶氧水平有利于菌體生長和酶的產量。裝液量30 mL時，上清發酵液中MCA和PA均達到最大，裝液量的增加會降低溶解氧水平，進而導致菌體濃度和MCA的顯著下降。

(4)與商業化凝乳酶相比，BD3256凝乳酶具有較高的MCA/PA值和良好的凝乳特性，凝乳過程中未出現凝乳過度水解和乳清析出的現象，具有很高的應用潛力。

參考文獻

[1]BRUNO M A,LAZZA C M,ERRASTI M E, et al. Milk clotting and proteolytic activity of an enzyme preparation fromBromeliahieronymifruits [J].LWT-Food Science and Technology,2010,43(4):695-701.

[2]NEELAKANTAN S,MOHANTY A K,KAUSHIK J K.Production and use of microbial enzymes for dairy processing [J]. Current Science,1999,77(1):143-148.

[3]DE LIMA C J B,CORTEZI M,LOVAGLIO R B,et al.Production of rennet in submerged fermentation with the filamentous fungusMucormieheiNRRL 3420 [J].World Applied Science Journal,2008,4:578-585.

[4]VENERA G D,MACHALINSKI C,ZUM’ARRAGA H,et al.Further characterization and kinetic parameter determination of a milk-clotting protease fromMucorbacilliformis[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,1997,68(3): 207-216.

[5]FAZOUANE-NAIMI F,MECHAKRA A,ABDELLAOUI R,et al.Characterization and cheese-making properties of rennet-like enzyme produced by a local Algerian isolate ofAspergillusniger[J].Food Biotechnology,2010,24(3): 258-269.

[6]LI Y,LIANG S,ZHI D,et al.Purification and characterization ofBacillussubtilismilk-clotting enzyme from Tibet Plateau and its potential use in yak dairy industry [J].European Food Research and Technology,2012,234(4): 733-741.

[7]JACOB M,JAROS D,ROHM H.Recent advances in milk clotting enzymes[J].International Journal of Dairy Technology,2011,64(1):14-33.

[8]IWASAKI S,YASUI T,TAMURA G,et al.Milk clotting enzyme from microorganisms [J].Agricultural and Biological Chemistry,1967,31(12):1 427-1 433.

[9]HE X,ZHANG W,REN F,et al.Screening fermentation parameters of the milk-clotting enzyme produced by newly isolatedBacillusamyloliquefaciensD4 from the Tibetan Plateau in China[J].Annals of Microbiology,2012,62(1): 357-365.

[10]SHIEH C J,THI L A P,SHIH L.Milk-clotting enzymes produced by culture ofBacillussubtilisnatto[J]. Biochemical Engineering Journal,2009,43(1): 85-91.

[11]SILVA B,GERALDES F,MURARI C,et al.Production and Characterization of a milk-clotting protease produced in submerged fermentation by the thermophilic fungusThermomucorindicae-seudaticaeN31[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,172(4):1 999-2 011.

[12]DE Castro R J S,NISHIDE T G,SATO H H.Production and biochemical properties of proteases secreted byAspergillusnigerunder solid state fermentation in response to different agroindustrial substrates[J].Biocatalysis and Agricultural Biotechnology,2014,4(3):236-245.

[13]ALVAREZ V,VON Der Weid I,SELDIN L,et al.Influence of growth conditions on the production of extracellular proteolytic enzymes inPaenibacilluspeoriae NRRL BD-62 andPaenibacilluspolymyxa SCE2[J].Letters in Applied Microbiology,2006,43(6):625-630.

[16]ANDRADE V S,SARUBBO L A,FUKUSHIMA K,et al.Production of extracellular proteases byMucorcircinelloidesusingD-glucose as carbon source/substrate [J].Brazilian Journal of Microbiology,2002,33(2):106-110.

[17]THAKUR M,KARANTH N,NAND K.Production of fungal rennet byMucormieheiusing solid state fermentation [J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1990,32(4):409-413.

[18]ARECES L B,BONINO M B D J,PARRY M A,et al.Purification and Characterization of a milk clotting protease fromMucorbacilliformis[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,1992,37(3):283-294.

[19]HASHEM A M.Optimization of milk-clotting enzyme productivity byPenicilliumoxalicum[J].Bioresource Technology,1999,70(2):203-207.

[20]MERHEB-DINI C,GOMES E,BOSCOLO M,et al.Production and characterization of a milk-clotting protease in the crude enzymatic extract from the newly isolatedThermomucorindicae-seudaticaeN31:(Milk-clotting protease from the newly isolatedThermomucorindicae-seudaticaeN31)[J].Food Chemistry,2010,120(1):87-93.

[21]LIU Y S,WU J Y,HO K P.Characterization of oxygen transfer conditions and their effects onPhaffiarhodozymagrowth and carotenoid production in shake-flask cultures[J].Biochemical Engineering Journal,2006, 27(3):331-335.

Study on milk-clotting enzyme produced byPaenibacillusspp. BD3526 in wheat bran broth

HANG Feng1,2，HONG Qing2，TAO Yuan1，WANG Qin-bo2，LIU Zhen-min2，CHEN Wei1

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy and Food Co., Ltd., Shanghai 200436,China)

ABSTRACTProteinase with milk-clotting activity (MCA) produced by Paenibacillus spp. BD3526 in fermented wheat bran broth were studied. The effects of different mediums, fermentation time, carbo sources, nitrogen sources and liquid volume in flask on MCA and proteolytic activity (PA) were discussed in this paper. The results indicated that MCA reached 3279.76±67.11 SU/mL and showed excellent coagulation property after fermentation in wheat bran broth for 24 hours. Addition of carbo source and nitrogen source would reduce MCA. The biomass, MCA and PA reached maximum when liquid volume in flask was 30 mL. No excessive hydrolysis of curds and whey syneresis were found after 40 minutes of coagulation of curd with BD3526 enzyme in comparison with the commercial coagulants, which suggested that it would have a great potential application in the cheese production.

Key wordsPaenibacillus spp.；coagulant；wheat bran；milk-clotting activity(MCA); proteolytic activity; PA

收稿日期：2015-08-03，改回日期：2015-09-14

基金項目：上海市科委啟明星人才計劃(14QB1400200)；國家“十二五”科技支撐計劃(2013BAD18B02)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601007

第一作者：博士研究生，高級工程師(陳衛教授為通訊作者，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn)