酵母對濃香型白酒糟醅中高級醇生成的影響

游玲，任羽，王濤，楊志榮*

1(四川大學 生命科學學院，四川 成都，610065)　2(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

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酵母對濃香型白酒糟醅中高級醇生成的影響

游玲1，任羽2，王濤2，楊志榮1*

1(四川大學 生命科學學院，四川 成都，610065)2(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000)

摘要為探究濃香型白酒酵母對混菌發酵糟醅中高級醇生成的影響，將24株分離自濃香型白酒釀造車間的酵母分別接種到未滅菌的液態及固態糟醅中，發酵50 d，檢測糟醅中9種高級醇的含量，發現分別僅有1株及4株酵母使固態及液態混菌發酵糟醅中的高級醇生成總量發生顯著變化，24株酵母對不同高級醇生成的影響不同，且無種屬特異性；與液態混菌發酵糟醅相比，固態混菌發酵糟醅中高級醇的生成受單一酵母菌株的擾動更小，且生成總量較少。結果表明，傳統自然固態發酵工藝在弱化外來酵母菌株造成的高級醇生成波動方面起著重要作用。

關鍵詞酵母；高級醇；混菌固態發酵

高級醇是指碳原子數大于2的醇類，白酒中主要是異丁醇、異戊醇、正丙醇、正丁醇等，在水中呈現油狀物，所以又叫雜醇油[1]。作為白酒中一類重要的香氣物質，高級醇不僅呈香呈味，還是多種酸、酯的前體，但含量超過一定限度，則使酒苦、辣、糙、澀，同時導致飲后上頭，影響人體健康。因此，在生產上，人們傾向于通過選用蛋白質含量低的釀酒原料，控制蒸餾條件，減少用曲量，人工催陳等[2-3]方法降低高級醇含量。

酵母與多種高級醇的生成密切相關，在對啤酒酵母產高級醇的相關研究中發現，不同啤酒酵母菌株對啤酒中高級醇的含量影響較大，選育低產高級醇的啤酒酵母用于啤酒生產是控制啤酒高級醇含量的關鍵[4-5]。白酒發酵過程中，影響高級醇生成的因素更多[6]，其中酵母的生長代謝仍是重要的影響因素[1]，如肖敏等[7]發現，分離自清香型白酒糟醅中的分屬于8個屬的33株酵母菌均可產生異丁醇和異戊醇，而正丙醇、正丁醇、正戊醇則由不同的酵母菌株產生。有目的地使用酵母可起到顯著調節發酵體系中高級醇生成的作用，如通過控制酵母菌生長調控醬香型白酒中雜油醇的生成[8]，通過添加活性干酵母、糖化酶降低濃香型白酒糟醅中高級醇總量[9]。

在啤酒、葡萄酒等純菌發酵過程中，人們通過多種手段來限制或調節高級醇的生成[10-12]，但在固態混菌發酵狀態下，參與高級醇相關代謝途徑的微生物眾多，在混菌發酵微生物區系形成的復雜共代謝網絡中，不同種屬酵母除自身代謝產高級醇外，還通過與其他微生物相互作用影響高級醇的生成，而固態發酵進一步增加了代謝產物的復雜性[13]。本研究選取分離自濃香型白酒釀造車間的24株酵母，研究其對固態或液態混菌發酵糟醅高級醇生成的影響，一方面通過濃香型白酒酵母影響白酒高級醇生成的種屬或菌株差異，探討混菌固態發酵條件下酵母群體與體系中高級醇生成的關系；另一方面，篩選到一些與固態發酵工藝條件相適應的，適用于調控發酵體系中高級醇種類及生成量的酵母菌株。

1材料與方法

1. 1材料

供試菌株：分離自川南多家知名濃香型白酒企業釀造車間的24株酵母，經26S rDNA特征序列鑒定，分屬于5個屬的8個種(結果另文發表)，其中Debaryomyceshansenii酵母8株(G8M-28、H9Y-30、S532Y-32、S632Y-20、S632Y-24、W8Y-4、Z8Y-19、Z8Y-91)，Wickerhamomycesanomalus酵母8株(H4Y-33、H5Y-26、H6Y-19、H9Y-16、S433Y-17、S442Y-9、W8Y-10、Z8Y-23)，Lodderomyceselongisporus酵母2株(W8Y-18、Z9Y-91)，Zygosaccharomycesbailii酵母2株(H1Y-24、 H6Y-22)，Pichiakudriavzevii酵母1株(S432Y-42)，Pichiamanshuricastrain酵母1株(Z4Y-31)，Trichosporonoidesspathulata酵母1株(SZ8Y-2)以及未鑒定到種的Pichia酵母1株(Z8Y-15)。

糟醅為川南某知名多糧濃香型白酒生產企業正常生產的入窖糧糟(添加20%的大曲)，其中酒精含量0.8%vol，黃水為對照窖池上一輪發酵黃水，酒精含量5.1%vol，取樣時間2013年12月。

1.2處理方法

菌懸液制備：將酵母純培養物劃線接種在YPD固態培養基上，30 ℃培養48 h，挑取菌落至50 mL無菌水，3 000 r/min離心5 min去除上清液，再重新懸浮洗滌菌體，通過調節添加無菌水的量調整菌懸液OD560值至0.5左右，4 ℃保存備用。

固態發酵：在釀造車間內，24株酵母菌懸液50 mL分別與2.5 kg入窖糧糟、30 mL黃水混合后分裝入3個體積為1 L的玻璃壇中(壇口自下而上用滅菌窖泥、壇蓋、保鮮膜將壇口封閉)，純菌固態發酵糟醅中添加10%葡萄糖混勻后經1×105Pa滅菌30 min，再接種對應酵母菌株，29 ℃遮光培養50 d。以等體積無菌水代替菌懸液接種作為空白對照。

液態發酵：在釀造車間內，24株酵母菌懸液15 mL分別與300 g入窖糧糟、30 mL黃水、600 mL蒸餾水混合后裝填入3個體積為1 L的三角瓶中(瓶口自下而上用保鮮膜將瓶口封閉)，純菌液態發酵為上述每個三角瓶中再另加入10 g葡萄糖，1×105Pa滅菌30 min后接種對應酵母菌株，50 r/min振蕩培養10 h后，29℃遮光培養50 d。以等體積無菌水代替菌懸液作為空白對照。

1.3分析檢測

固態發酵糟醅混勻后取100 g糟醅，加入200 mL無菌水，液態發酵樣品搖勻后直接取300 mL發酵液，200 mbar、150 r/min、80 ℃條件下分別蒸餾出100 mL蒸餾液，0.22 μm過濾后GC檢測，使用鄭州譜析公司生產的Lzp930色譜柱(30 m×0.32 μm)，載氣為高純氮氣，50 ℃保持3 min，以5 ℃/min 的速率升溫至150 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min 的速率升溫至190 ℃，保持5 min，最后以3 ℃/min 的速率升溫至220 ℃，保持10 min；進樣溫度220 ℃，進樣量0.2 μL，分流比20∶1。標樣采用鄭州譜析公司提供的9種高級醇混合標樣。

所得數據采用SPSS19. 0進行顯著性及相關性分析。

2結果分析

2.1酵母對液態發酵糟醅中高級醇生成的影響

由表1可知，24株酵母中僅有4株對液態混菌發酵糟醅中高級醇的生成總量有顯著影響，其中菌株S632Y-20與S442Y-9顯著降低了液態糟醅中的高級醇含量，菌株G8M-28、H6Y-22顯著促進了液態糟醅中高級醇的生成；11株酵母對混菌液態糟醅中1種以上高級醇造成顯著影響。但在液態滅菌糟醅中，酵母對高級醇生成的影響更大，15株酵母顯著影響其中的高級醇生成總量，且與空白對照相比，波動幅度在4.8%～5 409.5%；16株酵母可使至少1種高級醇的生成總量發生顯著變化，表明酵母與液態混菌體系中微生物群體間的相互作用削弱了酵母對高級醇生成的直接影響。

表1　酵母對液態發酵糟醅中高級醇生成的影響　單位：g/L

續表1

酵母菌株正丙醇仲丁醇異丁醇正丁醇異戊醇糠醇苯甲醇3-甲硫基丙醇β-苯乙醇未滅菌液態糟醅高級醇總量滅菌液態糟醅高級醇總量W8Y-40.9810.0960.4551.82*1.3630.1060.01700.2875.1560.114*Z8Y-151.4590.0780.5211.0961.7250.1530.0190.0200.3105.1260.332*S433Y-171.3280.0730.4751.5311.4810.1270.0210.0230.3605.3810.069*S632Y-240.8860.0920.5681.801*1.5160.0920.0200.0300.5235.4190.022Z8Y-231.8880.0810.5031.0811.6720.1620.01400.2755.5280.054S432Y-421.8530.0840.5110.7581.8040.1960.0150.0310.5145.6760.074*SZ8Y-22.1390.0840.5680.7951.9460.2200.0160.0170.1835.7660.071*W8Y-101.1780.0790.4862.025*1.3980.1340.0160.080*0.5715.9680.174*Z8Y-192.0820.0940.5781.0271.8630.2170.010*00.2445.9670.050H1Y-241.4120.0970.5752.111*1.6470.1360.0180.0300.160*6.1160.206*Z9Y-912.1030.0920.5981.6151.960.1820.01400.160*6.1860.135*G8M-282.5890.1050.6231.5822.1880.268*0.01400.2086.724*0.253*H6Y-223.142*0.1160.781*1.3222.712*0.298*0.0200.0260.2617.578*1.136*平均值1.4490.0910.4961.1051.5520.1550.0170.0200.3684.8020.194空白1.7570.0860.4530.8081.4720.1090.0260.0290.4155.1560.021平均增幅/%-17.55.79.636.75.441.6-36.1-30.3-11.3-4.6823.2

注:*表示差異顯著(P<0.05)。

酵母在液態發酵糟醅中純菌發酵主要產正丁醇及異戊醇(數據未列出)，這與肖敏等的研究一致[7]，但接種24株酵母的液態混菌發酵糟醅高級醇的平均生成總量僅比空白增加2.8%，其中糠醇的增幅最大(41.6%)，其次是異丁醇(9.6%)、仲丁醇(5.7%)、異戊醇(5.4%)，正丙醇、苯甲醇、3-甲硫基丙醇、苯乙醇生成量明顯下降，表明混菌液態發酵糟醅中，酵母對不同種類高級醇生成的影響更加復雜。

2. 2酵母對固態發酵糟醅中高級醇生成的影響

由表2可知，12株酵母接種滅菌固態糟醅后使其中高級醇的生成總量發生顯著變化，變化幅度在19.2%～1 851.2%，但僅有1株酵母(Z9Y-91)可使混菌固態發酵糟醅中高級醇的生成總量顯著增加，增幅為80.1%，波動幅度也較小。同時，接種不同酵母菌株的滅菌糟醅中高級醇的生成量差異極大，H5Y-26菌株可使滅菌糟醅中高級醇的生成量增加18.5倍，而S632Y-20使其中高級醇的生成量降低至空白的17.4%，但接種這2株酵母的未滅菌糟醅中高級醇的生成量均接近空白對照，表明與液態發酵類似，混菌發酵削弱了酵母對固態發酵糟醅中高級醇生成的影響。

表2　酵母對固態發酵糟醅中高級醇生成的影響　單位：g/kg

續表2

酵母菌株正丙醇 仲丁醇 異丁醇 正丁醇 異戊醇 糠醇 苯甲醇 3-甲硫 基丙醇 β-苯乙醇 未滅菌固態糟醅高級醇總量滅菌固態糟醅高級醇總量S432Y-420.3540.0660.1330.0500.3670.1850.0230.0440.0541.2761.978*H9Y-30-20.4040.0980.1390.0610.3740.1750.0180.0240.0421.3350.366Z4Y-310.3530.0750.1800.0440.4770.1400.0200.0100.0511.3501.002*Z8Y-910.3840.0880.1620.0690.4450.1130.0180.0150.0711.3651.223*S442Y-90.4010.1010.1700.0600.4550.0990.0270.0190.0541.3860.236H6Y-190.3390.0580.1690.0610.4320.2170.0220.0160.0771.3911.283*S632Y-240.463*0.1020.1690.0620.4900.1370.0220.0080.0321.4850.335W8Y-18-10.4360.110*0.1710.0630.4550.1430.0220.0140.0581.4720.084S532Y-320.4380.0980.1900.0550.4820.1360.0230.0120.0621.4960.263Z8Y-150.259*0.0730.1970.0421.022*0.1330.0160.0060.0271.7751.269*Z9Y-910.4480.0870.204*0.0610.5150.1600.652*0.0140.117*2.258*0.207平均值0.3570.0760.1500.0540.4210.1430.0460.0140.0591.3211.428空白0.3610.0680.1500.0500.3900.1630.0230.0060.0431.2540.453平均增幅/%-1.212.40.37.88.0-12.5100.9136.138.05.3215.3

注:*表示差異顯著性(P<0.05)。

從不同高級醇的增幅來看，苯甲醇及3-甲硫基丙醇的增幅最大，均超過100%，表明酵母對這兩種高級醇的生成有一定促進作用，其次是β-苯乙醇，而正丙醇及糠醇的生成量下降，與液態混菌發酵糟醅不同的是，固態發酵促進了在高級醇總量中所占比例較少的幾種高級醇的生成，使整體風味更加復雜協調。

另一方面，不同酵母對混菌發酵糟醅中不同高級醇生成的影響有明顯差異，如在固態混菌發酵糟醅中，S632Y-24及Z8Y-15顯著增加正丙醇的生成量，菌株H9Y-16-A及Z9Y-91顯著促進β-苯乙醇的生成，表明可通過接種酵母來調控混菌發酵糟醅中不同高級醇的生成量，進而達到調整白酒風味的目的。

另外，從表1、2中還可以看出，無論接種哪一株酵母或是否接種酵母，液態混菌發酵糟醅中高級醇的生成量都高于固態混菌發酵糟醅，表明固態發酵方式可減少高級醇的生成。

圖1　接種不同酵母的固態及液態混菌發酵糟醅中的高級醇聚類圖Fig.1　Systematical cluster analysis depended on high alcohols in submerged and solid fermentative grain supplemented by 24 yeast strains

以接種24株株酵母的液態及固態發酵糟醅中各類高級醇的含量為聚類指標，分別對24個實驗處理進行系統聚類(圖1)，發現固態混菌發酵糟醅的25個處理僅聚為4個分支，且其中23個處理被劃分到2個主要分支，而液態發酵的25個處理分支數達15個，不同分支間隔也較遠，且無論是固態還是液態糟醅，均存在屬于同一個種的酵母分布在不同分支，不同種屬酵母分布在同一分支的現象，未體現酵母影響高級醇生成的種屬特異性，說明發酵方式(固態或液態)對混菌發酵糟醅中高級醇生成的影響大于酵母種屬差異，針對外來酵母對混菌發酵體系中高級醇代謝的沖擊，固態混菌發酵糟醅較液態更加穩定。這可能是因為固態糟醅環境中界面更豐富，可在其中生長代謝的微生物種類更多，相互之間協同生長、代謝狀況更復雜，這可能正是傳統白酒發酵多選擇固態發酵工藝的部分原因。

并且，接種同一酵母菌株的液態與固態發酵糟醅中高級醇的種類、含量差異也較大，如接種W8Y-4菌株的混菌固態發酵糟醅中糠醇含量顯著低于空白，而液態混菌發酵糟醅中糠醇的生成量無明顯變化，這進一步印證了酵母對液態及固態混菌發酵糟醅中高級醇生成的影響差異，在圖1中則體現為固態發酵聚類在一起的酵母菌株，在液態發酵中相隔甚遠，反之亦然。

2.3兩種發酵條件下高級醇生成途徑的相關性分析

在混菌固態發酵環境下(表3)，正丙醇與正丁醇、異丁醇、仲丁醇的生成、異丁醇與異戊醇的生成、β-苯乙醇與苯甲醇的生成顯著相關，可能是由于這些高級醇具有相似的碳架結構及生成途徑；而異丁醇與苯甲醇的生成顯著相關，其原因尚有待進一步研究。

表3　固態混菌發酵糟醅中不同高級醇生成的相關性

注:*表示差異顯著性P<0.05；**表示差異顯著性P<0.01(表4與此相同)。

在混菌液態發酵環境下(表4)，與固態相似，C3-C5高級醇相互之間的關聯較密切，但仍有明顯差異，如正丙醇與異丁醇、異戊醇的生成顯著相關，但與仲丁醇的相關性不顯著，異丁醇與正丁醇、異戊醇的生成顯著相關；同時，β-苯乙醇僅與3-甲硫基丙醇、異戊醇的生成顯著相關，與苯甲醇的相關性不顯著；差別最大的則是糠醇，固態發酵環境中糠醇的生成與其他高級醇之間缺乏相關性，而在液態發酵環境中，糠醇的生成與正丙醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇這4種高級醇的生成顯著相關，表明固態發酵對糠醇的生成途徑有明顯影響，而異丁醇與正丙醇、異戊醇在兩種發酵環境下均呈現顯著相關，表明這兩組高級醇生成的微生物共代謝途徑相對較穩定。

表4　液態混菌發酵糟醅中不同高級醇生成的相關性

3討論

在白酒生產過程中，添加酵母可提高乙醇的生成量，但是否會影響糟醅中高級醇等風味物質的生成，人們一直心存疑慮?；诒狙芯康膶嶒灲Y果，關于酵母對混菌發酵糟醅中高級醇生成的擾動，本研究可得出以下3點主要結論：(1)不同酵母對固態或液態混菌發酵糟醅中高級醇生成的影響不同，僅少數酵母菌株對高級醇生成總量有顯著影響；(2)固態混菌發酵比液態混菌發酵更明顯地削弱了外來酵母對高級醇生成的影響；(3)對混菌發酵體系來說，與外來酵母菌株相比，發酵工藝(固態或液態)對混菌體系中高級醇生成的影響更大，傳統固態發酵工藝在穩定及調整微生物區系波動造成的影響方面可能起著非常重要的作用。

MANGAS[14]發現，75%的高級醇來自糖代謝途徑，25%來自氨基酸代謝途徑，而這兩種途徑均與α-酮酸有關。從兩種發酵環境中高級醇的生成差異來看，液態糟醅中高級醇的生成量普遍高于固態糟醅，一方面可能是由于液態發酵糟醅的均質性及流動性使生成的高級醇均勻分散到體系中，解除了反饋抑制，使得高級醇的生成朝著正反應方向進行；但更主要的原因可能是由于液態發酵環境中氧氣含量較少，導致累積的α-酮酸不能完全氧化成CO2和H2O，并在酮酸脫羧酶及脫氫酶的作用下進一步生成高級醇[9]，結合郝欣等[15]關于酵母丙酮酸脫羧酶對高級醇的生成無明顯影響的報道，我們認為溶氧量對混菌發酵糟醅α-酮酸轉化為高級醇的可能更大。同時，由于高級醇的生成還受到氨基酸種類、含量及其相互之間代謝轉換關系的影響，因此還可通過監測發酵體系中高級醇、溶氧、氨基酸、α-酮酸及蛋白酶、轉氨酶、酮酸脫羧酶等酶活性的變化來進一步分析兩種發酵環境中的高級醇代謝途徑差異。

另外，本研究還得到數株可減少固態混菌發酵糟醅中高級醇生成，特別是減少某些不良高級醇，如正丙醇(苦澀味)生成的酵母菌株，后續將對這些酵母產乙醇能力、產酸能力、對混菌微生物區系的影響等開展研究，最終用于濃香型或其他香型白酒固態發酵。

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Effects of yeasts on higher alcohols forming in Chinese strong-flavored liquor producing

YOU Ling1REN Yu2WANG Tao2YANG Zhi-Rong1*

1(College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610065, China)2(Soild-state Fermentation Resource Utilization Key Laboratory of Sichuan Province, College of Life Science and Food Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China)

ABSTRACTTo explore the effects on higher alcohols forming in fermentative grains of yeast strains associated with the Chinese strong-flavored liquor producing, 24 strains isolated from the fermentation workshop were inoculated to unsterilized solid or submerged fermentative grain and the contents of 9 higher alcohols in both fermentation system were detected after fermentation for 50 d. Results showed that only 1 yeast strain changed the total content of higher alcohol significantly in unsterilized solid and 4 yeast strains changed that in submerged fermentative grain. The different impacts of 24 yeast strains on different higher alcohols were different, while no species specificity was found. Compared with the fermentation in unsterilized submerged fermentative grain, the fluctuation caused by yeast strains was weakened in unsterilized solid fermentative grain, and the total content of 10 higher alcohols was reduced. The results indicated that the technology of traditional natural solid fermentation played an important role in hindering the impacts led by foreign yeasts.

Key wordsliquor yeasts; higher alcohols; mixed solid fermentation

收稿日期：2015-07-13，改回日期：2015-09-14

基金項目：四川省科技廳支撐計劃項目(15ZC0141)；四川省教育廳基金項目(15ZB0291)；宜賓學院青年基金項目(2011Z26)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601005

第一作者：博士研究生，助理研究員(楊志榮為通訊作者，E-mail：bioyang@163.com)。