BDH2基因過表達對啤酒酵母雙乙酰代謝的影響

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BDH2基因過表達對啤酒酵母雙乙酰代謝的影響

石婷婷，李憑，肖冬光*

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學 生物工程學院，天津,300457)

摘要利用基因工程手段，采用PCR技術擴增啤酒酵母S2中的雙乙酰還原酶基因BDH2，構建了BDH2基因整合過表達的重組酵母菌株B2Z。利用real-time PCR的方法對酵母BDH2基因的表達水平進行了檢測，相比于出發菌株，其BDH2基因的表達水平提高到原來的7.35倍。啤酒發酵實驗表明，BDH2基因的過表達對雙乙酰的降低有效果，B2Z雙乙酰的峰值和雙乙酰最終含量比出發菌株S2分別降低42.61%和32.73%，其他啤酒指標如酒精度、發酵度、殘糖和風味物質與出發菌株略有變化，但各物質的濃度都在優質啤酒建議的范圍之內，符合啤酒發酵的指標要求。

關鍵詞啤酒；BDH2基因；基因工程；釀造；雙乙酰

雙乙酰是啤酒發酵過程中的重要副產物，它與2,3-戊二酮合稱為連二酮，連二酮是影響啤酒風味成熟的重要物質。啤酒中2,3-戊二酮的含量遠低于雙乙酰，但是2,3-戊二酮的風味閾值又大大高于雙乙酰，因此，雙乙酰是決定啤酒風味成熟的重要物質，當啤酒中雙乙酰的含量超過閾值就會產生一種令人不愉快的搜飯味，影響啤酒的感官質量[1-3]。

雙乙酰是由啤酒酵母細胞通過纈氨酸代謝途徑產生的α-乙酰乳酸(α-acetolactate)產生的，分泌至細胞外的α-乙酰乳酸經過非酶促的氧化脫羧反應自生合成雙乙酰，生成的雙乙酰被酵母重新吸收，在雙乙酰還原酶的作用下被還原成乙偶姻，乙偶姻被乙偶姻還原酶進一步還原成2,3-丁二醇，再次分泌至細胞外[4-6]，乙偶姻在啤酒中的風味閾值為3～50 mg/L，遠大于雙乙酰的0.1 mg/L，可促進啤酒口味達到成熟[7]。但在后酵和貯酒過程中，酵母數量少，且還原雙乙酰的速度慢，造成雙乙酰還原周期長，一般在啤酒發酵后期還原雙乙酰需要約5～10 d[8]，此階段占啤酒釀造過程總時間的60%以上，因而雙乙酰的形成與消除是啤酒風味成熟的重要限速步驟。BDH2基因所編碼的雙乙酰還原酶是雙乙酰還原成乙偶姻過程中的關鍵酶[9]，增加BDH2基因的拷貝數，可加快雙乙酰的還原，減少雙乙酰。本研究通過分子生物學的方法，將BDH2基因置于強組成型啟動子后，在啤酒工業酵母中進行了加強表達，并進行啤酒發酵實驗，檢測發酵液中雙乙酰的含量變化及其發酵性能，并利用real-time PCR的方法對酵母BDH2基因的表達水平進行了檢測。

1材料和方法

1.1菌株和質粒(表1)

表1　本實驗所使用菌株和質粒

1.2試劑和工具酶

引物，委托鼎國生物技術有限公司合成；高保真性DNA 擴增酶采用TransTaqHiFi，購自北京全式金生物技術有限公司；限制性內切酶、DNA 連接酶、去磷酸化酶購自大連寶生物公司；DNA提取試劑盒購自大連寶生物公司；G418、氨芐青霉素購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；鮭魚精DNA，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3主要培養基

YEPD培養基：10 g/L酵母提取物，20 g/L葡萄糖，20 g/L蛋白胨，pH 6.0，121 ℃滅菌20 min。

YEPD(G418)培養基：YEPD固體培養基溶化后，降溫至60℃左右時加入一定量的G418儲存液，使得G418的最終質量濃度為600 mg/L。

LB培養基：10 g/L胰蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母提取物，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

LB(Ampr)培養基：LB固體培養基溶化后，降溫至60 ℃左右時加入一定體積的100 mg/mL的氨芐青霉素溶液，使得氨芐青霉素的最終質量濃度為100 mg/L。

麥芽汁培養基：稱量一定量的粉碎的麥芽，按1∶4的料水比于65 ℃糖化至碘檢完畢，用糖度計調整外觀糖度至12°Brix，115 ℃滅菌20 min。

以上培養基的固體培養基需加20 g/L瓊脂。

1.4實驗方法

1.4.1引物設計(表2)

表2　本研究所用引物

1.4.2E.coli的轉化

質粒和PCR擴增好的片段在E.coli中進行轉化[10]，構建BDH2過表達質粒。

1.4.3啤酒酵母的轉化劑轉化子鑒定

酵母轉化采用醋酸鋰轉化法[11]。并且利用G418篩選轉化子，提取酵母轉化子的基因組后采用PCR 進行驗證，設計轉化子上不同位置的引物進行PCR 驗證， 如果能夠擴增得到預期大小的條帶，則說明是正確的轉化子。

1.4.4BDH2基因表達量的測定

利用real-time PCR的方法[12]檢測BDH2基因表達量的變化。

1.4.5CO2失重的測定

發酵初期每天稱重測定發酵液的質量。

1.4.6雙乙酰的測定(啤酒分析方法)

應用采用鄰苯二胺比色法測定[13]。

1.4.7還原糖、酒精度及發酵度的測定

還原糖采用斐林試劑法測定[14]；酒精度和發酵度的測定依據啤酒分析方法進行測定[13]。

1.4.8風味物質的測定

啤酒發酵液經蒸餾后采用氣相色譜法測定。內標物為乙酸正戊酯。氣相色譜儀為Agilent 7890C；色譜柱 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 260 ℃：30 m×320 μm×0.5 μm，配FID檢測器。載氣為高純氮，流速2.5 mL/min。起始柱溫為50 ℃，保持2 min，以 5℃/min的升溫速度升至80 ℃，保持2 min，最后以10 ℃/min 的升溫速度升至100 ℃。檢測器溫度為250 ℃，進樣口溫度為230 ℃，進樣量為0.4 μL。分流方式為分流，分流比為20∶1。

1.5啤酒發酵實驗

一級種子培養：取斜面菌種1環，接種于裝有5 mL的12 °Brix麥汁培養基的試管中，在28 ℃、180 r/min下培養24 h。

二級種子培養：一級種子液按質量分數10%的接種量接入盛有50 mL的12 °Brix麥汁的150 mL三角瓶內，16 ℃靜置培養72 h。

啤酒發酵：二級種子液經過離心得到酵母泥，酵母泥按質量分數0.5%的接種量接入盛有250 mL的12 °Brix麥汁的三角瓶內，10 ℃靜置發酵9 d，4 ℃后酵至15 d。

2結果與分析

2.1BDH2過表達質粒的構建

選用一種酵母菌游離型質粒穿梭載體YEp352，一種組成型表達的釀酒酵母強啟動子PGK，使插入到PGK啟動子和終止子之間的目的基因可以在釀酒酵母中過量表達。本實驗研究的出發釀酒酵母菌株對G418敏感，因此選擇G418抗性作為篩選標記。

游離型質粒穿梭載體YEp352和PGK片段經BamHI 和SalI 酶切處理后，用DNA連接酶過夜連接，將PGK連接到YEP352質粒上；克隆目的基因BDH2，經XhoI酶切處理并去磷酸化后，插入表達載體YEP352上的PGK啟動子和終止子之間；KANMX基因盒從PUG6質粒上進行PCR擴增，經BamHI酶切處理后并去磷酸化，連接到表達載體YEP352上的BamHI位點。成功構建了含有PGK1強啟動子、目的基因BDH2和KANMX抗性基因的BDH2過表達重組質粒YEP-KPB2，見圖1。

圖1　重組質粒YEP-KPB2構建的流程Fig.1　Construction of recombinant plasmid YEP-KPB2

2.2重組酵母菌株的構建

以重組質粒YEP-KPB2為模板，GB2-UP和GB2-DOWN為引物擴增擴增得到重組片段“KanMXPGK+BDH2”。然后利用醋酸鋰轉化法使敲除盒與出發菌株S2基因組的BDH2基因上發生同源重組，生長在G418質量濃度為600 mg/L的YEPD平板上。對生長的轉化子進行PCR驗證，即以轉化子基因組為模板，以K-UP和K-DOWN為引物，能夠擴增得到1 600 bp的片段，與理論上KanMX基因大小一致，說明KanMX基因已經整合入轉化子染色體上；再次，驗證重組片段的各個組件是否都發生了正確的重組，以YZ-SUP和YZ-SDOWN為引物，能夠擴增得到481 bp的片段；以YZ-XUP和YZ-XDOWN為引物，能夠擴增得到780 bp的片段，并以出發菌株S2的基因組為對照模板，沒有PCR擴增出相應的片段，說明轉化子發生了正確的同源重組。轉化子的PCR 驗證結果見圖2。最終篩選得到BDH2基因整合過表達的重組菌株，命名為B2Z。

圖2　BDH2整合過表達重組菌株PCR驗證Fig. 2　PCR analysis of the yeast recombinants with BDH2 overexpression1, 2 以K-UP和K-DOWN為引物進行驗證；3, 4 以YZ-SUP和YZ-SDOWN為引物進行驗證；5, 6 以YZ-XUP和YZ-XDOWN為引物進行驗證；1, 3, 5 模板為出發菌株S2的基因組；2, 4, 6 模板為BDH2整合過表達重組菌株B2Z的基因組

2.3BDH2基因表達量的測定

利用real-time PCR的方法對酵母BDH2基因的表達水平進行了檢測，見圖3。

圖3　重組菌株與出發菌株BDH2基因表達量對比Fig.3　Measurement of of expression levels of BDH2 gene in the recombinant strain and the host strain by real time PCR

由圖3可知，BDH2基因的過表達，增加了BDH2基因的拷貝數，重組菌株相比于出發菌株，其BDH2基因的表達水平提高到原來的7.35倍。

2.4啤酒發酵期間CO2失重的變化

從發酵開始到發酵第9天，每天稱重發酵液的質量，計算累計CO2失重，比較重組菌株和出發菌株的發酵速率，見圖4。

圖4　重組菌株和出發菌株累計CO2失重的對比Fig. 4　Comparison of cumulative CO2 weightlessness of the recombinant yeast strain and the host strain

由圖4可知，重組菌株B2Z和出發菌株S2，在發酵2～7 d累計CO2失重均呈對數值增加，在第9天時基本不再增加，期間，重組菌株B2Z的累計CO2失重比出發菌株S2略低，但是整體發酵趨勢與S2一致，說明BDH2基因的過表達沒有影響酵母的生長速率，也沒有影響啤酒發酵的速度。

2.5重組菌株與出發菌株雙乙酰代謝的比較

在啤酒發酵過程中測定了重組菌株和出發菌株的雙乙酰的峰值，發酵結束時，測定了各菌株的雙乙酰含量，見圖5。

圖5　重組菌株與出發菌株雙乙酰代謝的對比Fig. 5　Comparison of diacetyl metabolic of the recombinant yeast strain and the host strain

由圖5可知，在啤酒發酵過程中，重組菌株的雙乙酰峰值比出發菌株降低了，出發菌株S2，重組菌株B2Z的雙乙酰峰值分別為1.15 mg/L和0.66 mg/L，比出發菌株S2降低了42.61%；發酵結束時，出發菌株S2，重組菌株B2Z的雙乙酰最終含量分別為0.55 mg/L和0.37mg/L，比出發菌株S2降低了32.73%。研究發現，利用質粒Yep352和磷酸甘油酸激酶基因PGK1的啟動子，將啟動子PGK1插入Yep352質粒中，驅動了下游目的基因BDH2的表達，使其拷貝數得以增加，提高目的基因BDH2的基因表達水平，可以降低雙乙酰的含量，BDH2基因的過表達對啤酒發酵中雙乙酰的降低有效果。

2.6啤酒發酵結束后殘糖、酒精度及發酵度的測定

發酵結束時，測定了各重組酵母菌株與初發菌株的酒精度，真正發酵度和殘糖，見表3。

表3　重組菌株與出發菌株酒精度、真正發酵度

由表3看出，在發酵結束后重組菌株相比于出發菌株，殘糖略高，酒精度略低于S2。在發酵結束后重組菌株與出發菌株在酒精度、殘糖、外觀發酵度和真正發酵度等指標上沒有明顯差異，并且各項指標均符合國家規定的標準，說明BDH2基因的過表達并沒有明顯影響到這些啤酒基礎指標，重組菌株符合啤酒發酵的指標要求，具有一定的實際應用潛力。

2.7啤酒發酵結束后風味物質的測定

發酵結束時，測定了各重組酵母菌株與初發菌株之間代謝產生主要高級醇和酯類物質，見表4。

結果表明，BDH2基因過表達的重組酵母菌株與出發菌株釀制的啤酒相比，其發酵液中含有的某些主要高級醇和乙酸乙酯的量有所降低，乳酸乙酯和乙偶姻的量有所提高。這可能是雙乙酰代謝途徑某些物質代謝流發生變化導致一些醇類物質和酯類物質代謝能力的變化，BDH2基因的過表達降低了雙乙酰的含量，使雙乙酰還原為乙偶姻，因此乙偶姻的含量提高了。雖然各風味物質的量有所變化，但都在優質啤酒建議的范圍之內。

表4重組菌株與出發菌株風味物質的比較

單位：mg/L

注：a代表重組菌株與出發菌株代謝產風味物質的量具有明顯的差異(Student’s t testP≤0.05)。

3結論

以實驗室保藏菌株為出發菌株，利用分子生物學方法對BDH2基因進行了整合過表達。進行啤酒發酵實驗，結果顯示BDH2基因的過表達確實能有效的降低雙乙酰的含量，與出發菌株S2相比，雙乙酰峰值降低了42.61%，最終雙乙酰含量降低了32.73%。 利用real-time PCR的方法對酵母BDH2基因的表達水平進行了檢測，相比于出發菌株，其BDH2基因的表達水平提高到原來的7.35倍。在啤酒發酵中，雙乙酰的閾值范圍為0.1～0.15 mg/L，本文中的啤酒發酵是實驗室三角瓶小試發酵，未能達到工業上啤酒發酵的條件，因此，在后期雙乙酰還原時未能使雙乙酰還原到其閾值范圍。其他啤酒指標如酒精度、發酵度、殘糖和風味物質比出發菌株略有變化，但各物質的濃度都在優質啤酒建議的范圍之內，符合啤酒發酵的指標要求。

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Effects of overexpression ofBDH2 gene on diacetyl metabolic in beer yeast

SHI Ting-ting，LI Ping，XIAO Dong-guang*

(Key Lab of Industrial Fermenting Microbiology, Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China)

ABSTRACTIn this paper, new industrial brewer’s yeast strains B2Z with BDH2 gene overexpression was constructed using genetic engineering by PCR amplification of the diacetyl reductase gene BDH2 in beer yeast S2. The expression levels of BDH2 gene in the recombinant strain and the host strain was measured by real time PCR, and compared with the host strain, the BDH2 gene expression level of B2Z was increased to 7.35 times. Beer fermentation experiments showed that overexpression of BDH2 gene could reduce the production of diacetyl, and the diacetyl peak and diacetyl concentration were decreased by 42.61% and 32.73% compared with those in the host strain S2. Other indicators such as alcohol, beer fermentation degree, residual sugar and flavor changed slightly, but were still in the suggested range of high quality beer, and conformed to the index requirements of beer fermentation.

Key wordsbeer; BDH2 gene; genetic engineering; brewing; diacetyl

收稿日期：2015-09-23，改回日期：2015-11-09

基金項目：食品微生物基因組改造(國家863計劃)(2012AA022108)；教育部“長江學者和創新團隊發展計劃”(IRT1166)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602003
第一作者：博士(肖冬光教授為通訊作者，E-mail:xiao99@tust.edu.cn)。