紹興黃酒混濁蛋白的分離鑒定及其氨基酸組成、二級結構分析

孫軍勇，樊世英，謝廣發，陸健,5

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)　2(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)　3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)　4(中國紹興黃酒集團有限公司 國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，312000)　5(宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇 宿遷，223800)

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紹興黃酒混濁蛋白的分離鑒定及其氨基酸組成、二級結構分析

孫軍勇1,2,3，樊世英1,2,3，謝廣發3,4，陸健1,2,3,5

1(江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)4(中國紹興黃酒集團有限公司 國家黃酒工程技術研究中心，浙江 紹興，312000)5(宿遷市江南大學產業技術研究院，江蘇 宿遷，223800)

摘要采用雙向電泳及基質輔助激光解析電離飛行時間串聯質譜法分析了紹興黃酒混濁蛋白的主要組成及來源，結果表明：紹興黃酒混濁中的蛋白質主要包括來源于小麥類燕麥蛋白b1、類燕麥蛋白、二聚-α淀粉酶抑制劑、病程相關蛋白、病程相關蛋白-4、幾丁質酶II，以及來源于水稻的類燕麥蛋白和β-淀粉酶。高效液相色譜與傅里葉變換紅外線光譜分析法分析紹興黃酒上清蛋白質和混濁蛋白質的氨基酸組成與二級結構發現，紹興黃酒混濁蛋白中谷氨酸含量最高，占總氨基酸含量的20.48%，疏水性的氨基酸含量比酒體蛋白高24.2%。高α-螺旋含量、低β-折疊和無規則卷曲是黃酒混濁中蛋白質的主要結構特征。

關鍵詞黃酒；混濁蛋白；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF/TOF MS)；氨基酸組成；二級結構

黃酒是一種成分復雜、營養豐富的膠體溶液，含有蛋白質、氨基酸、多酚、糖、金屬離子等物質。在存儲的過程中，黃酒受到光照、震動、氧氣的影響，膠體平衡被打破而出現失光、絮凝和混濁[1]。

近年來，很多研究者[2-5]對黃酒混濁的成分進行了分析。丁關海[6]對壇裝和瓶裝酒的混濁成分進行了研究，發現壇裝酒混濁中粗蛋白占34.66%，瓶裝酒混濁中粗蛋白占了50.56%。謝廣發等[5]對瓶裝酒的混濁成分的分析表明，其粗蛋白含量達到50.6%，其中高分子蛋白占總蛋白含量72.62%。以上研究均說明蛋白是黃酒混濁的主要成分。然而，研究人員發現[7-8]，盡管高分子蛋白質在混濁中所占的比例較大，但黃酒的穩定性并不隨著黃酒中高分子蛋白質含量增高而降低，而可能與黃酒中某類容易形成混濁的特定蛋白質有關。本研究室譚新勇[9]研究發現，黃酒的混濁蛋白的分子量主要集中在14～16 kDa、21～23 kDa附近，混濁蛋白中富含谷氨酸，但其并未對混濁蛋白的氨基酸組成特征和二級結構特征進行深入分析。

本文通過雙向電泳(2-DE)和基質輔助激光解析電離飛行時間串聯質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF/TOF MS)技術追溯紹興黃酒混濁蛋白質的種類和來源，并采用高效液相色譜(high performance liguid chromatography,HPLC)技術對紹興黃酒混濁中的蛋白質的氨基酸組成進行分析，通過傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)技術分析混濁蛋白二級結構，目的是更深入認識紹興黃酒混濁蛋白質，為紹興黃酒的蛋白混濁問題的解決提供新的理論指導。

1材料與方法

1.1材料與儀器

黃酒樣品：塔牌紹興花雕酒，古越龍山陳年花雕酒，購于本地超市，酒精度均≥15.5%(vol)，總糖均為15.1～40.0 g/L，產地均為浙江紹興。

3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)、碘乙酰胺(IAA)、二硫蘇糖醇(DTT)、尿素、固相IPG膠條(7 cm，pI 3～10，非線性)、IPG緩沖液(pH 3～10，非線性)為GE公司產品。α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、碳酸氫銨、三氟乙酸(TFA)、胰蛋白酶、乙腈等試劑等購于Sigma公司。30%丙烯酰胺單體儲液、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250、三氯乙酸(TCA)、丙酮、尿素、β-巰基乙醇、蛋白標準品、透析袋、N-[三(羥甲基)]甘氨酸(Tricine buffer)，均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

蛋白電泳系統(Mini-Protein 3 Cell)，美國Bio-Rad公司；高速冷凍離心機，美國Sigma公司；Ultraflextreme串聯飛行時間質譜儀，德國Bruker公司；UV-2100紫外可見分光光度計，尤尼克上海儀器公司；WGZ-2-PJ型濁度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；K2300凱氏定氮儀，丹麥Foss有限公司；Agilent 1100型氨基酸專用高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；傅里葉變換紅外光譜儀Nexus Nicolet 470，美國Thermo Nicolet公司。

1.2實驗方法

1.2.1雙向電泳

按照參考文獻[10]方法制備樣品。

1.2.2蛋白質鑒定

切取凝膠上可見的蛋白條帶或蛋白點，用雙蒸水沖洗膠粒2次，加入200 μL含有100 mmol/L NH4HCO3的30%乙腈溶液，振蕩直至膠粒無色，去除脫色液，加入50 μL無水乙腈，脫水2次后得白色膠粒。每管加入5 μL胰蛋白酶液，置于4 ℃冰箱中30～60 min，使膠粒完全吸收酶液，然后去除多余酶液，加入20 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液，37 ℃水浴20 h。將酶解液轉移到新離心管中，在原管中加入萃取液進行超聲萃取，然后將酶解液和萃取液混合，進行旋轉真空濃縮，濃縮至3 μL左右時停止，如果濃縮干燥，則加入TA60溶液3 μL振蕩復溶。吸取0.7 μL樣品點樣，干燥后加0.7 μL基質，干燥后采用MALDI-TOF/TOF MS質譜儀對樣品進行肽質量指紋圖譜分析。一級質譜數據采集模式采用正離子反射模式與自動獲取數據模式，掃描范圍為700～3500 Da。選取5～10個信號強度較好的一級質譜峰進行二級質譜分析，使用BioTools軟件進行整合，用Mascot軟件(http://www.matrixscience.com)在NCBInr中對質譜數據進行搜索匹配。

1.2.3氨基酸分析

(1)游離氨基酸測定[11]：參照文獻[11]。

(2)總氨基酸測定：取一定量的黃酒混濁蛋白或黃酒樣品，加入濃鹽酸，110 ℃水解22 h，轉移到容量瓶中定容后過濾，經過蒸酸、離心，按照參考文獻[11]的方法進行測定。

(3)氨基酸疏水性分析：根據Lozano等[12]的經驗公式計算氨基酸的疏水性，并計算氨基酸平均疏水值Hφavg。

1.2.4黃酒混濁蛋白的二級結構分析

(1)樣品預處理

混濁蛋白：購買市場上已經產生混濁的黃酒，靜置5 d，采用虹吸法將上清酒液去除，留下底部約80 mL酒樣，振蕩混勻后，12 000 r/min下離心30 min，收集沉淀。將沉淀裝入1 000 Da的透析袋在流動水中透析48 h，冷凍干燥后，進行傅里葉紅外光譜分析。

黃酒上清液：向黃酒中添加硫酸銨至飽和度為80%，4 ℃冰箱過夜，離心收集沉淀，將沉淀物轉入截留分子量1 000 Da的透析袋，透析48 h，冷凍干燥后，進行傅里葉紅外光譜分析。

(2)傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)

冷凍干燥后的蛋白質樣品的傅里葉變換紅外光譜分析按照參考文獻[13]的方法進行。譜圖處理按照參考文獻[14]的方法進行。

2結果與分析

2.1黃酒混濁蛋白質的雙向電泳分析

由于黃酒的混濁成分復雜，含有多酚、糊精、金屬離子、蛋白質等多種成分[5,15]，并且沉淀中的蛋白質可能與多酚結合形成大分子物質，傳統的TCA-丙酮沉淀處理樣品的方法難以得到高質量的混濁蛋白質樣品用于雙向電泳，因此，在對混濁蛋白的處理中，采用酚抽提結合TCA-丙酮沉淀的方法處理混濁樣品，雙向電泳結果見圖1。

a-瓶裝黃酒混濁蛋白雙向電泳圖譜；b-古越龍山未進行穩定性處理黃酒樣品混濁蛋白圖1　不同黃酒樣品混濁蛋白質雙向電泳圖譜(7 cm，pH 3～10，NL)Fig.1　2-DE profiles of haze proteins in Chinese rice wine samples(7 cm, pH 3～10, NL)

從圖1可以看出，在瓶裝黃酒與未進行穩定性處理的黃酒自然存放產生的沉淀物質中，蛋白質的分布相似，主要為酸性蛋白區和低分子堿性端蛋白質。在酸性端與堿性端中間分布的蛋白質點較少且顏色淺，這說明混濁蛋白質中這類蛋白質的含量較少。低分子堿性端蛋白點顏色較深，蛋白質含量較大。

2.2黃酒混濁蛋白質的MALDI-TOF/TOF MS鑒定分析

挖取圖1中的蛋白點進行質譜分析及全數據庫蛋白質檢索，共鑒定成功15個點，鑒定成功的蛋白質點標于圖1中，各蛋白質點的鑒定結果見表1。

從表1中可以看出，鑒定成功的混濁蛋白共有9種。在這些蛋白中，來源于小麥的蛋白質有6種，分別為類燕麥蛋白b1、類燕麥蛋白、二聚α-淀粉酶抑制劑、病程相關蛋白、病程相關蛋白-4(wheatwin1)、病程相關蛋白-4、幾丁質酶II等，它們的分子量分布在13 ～16 kDa和28～46 kDa之間，在混濁蛋白質中占較大比重，是混濁蛋白最主要的來源；來源于水稻的蛋白質有類燕麥蛋白和β-淀粉酶，分子質量分別為33.4 kDa和55.4 kDa。

表1　黃酒混濁蛋白質譜鑒定結果(7 cm，pH 3～10，NL)

由鑒定結果可知，混濁蛋白質主要來源于黃酒釀造原料麥曲和糯米。二聚α-淀粉酶抑制劑的蛋白點最多，均來源于小麥，病程相關類蛋白次之(PR、PR-4、幾丁質酶II)，其次為類燕麥蛋白、β-淀粉酶。經查閱文獻發現，二聚α-淀粉酶抑制劑和類燕麥蛋白同樣是啤酒混濁蛋白的組成部分[16]，幾丁質酶在葡萄酒混濁中也有發現[17]。

二聚α-淀粉酶抑制劑是α-淀粉酶抑制劑的二聚體。α-淀粉酶抑制劑最早發現于小麥種子中，是一種糖水解酶抑制劑，對不同來源的α淀粉酶都有強烈的抑制作用，在小麥種子中主要存在12、24、60 kDa三種形式，其中12kDa為單體的α-淀粉酶抑制劑，24、60 kDa分別為二聚體和四聚體[18-20]。α-淀粉酶抑制劑可以抑制內生性淀粉酶的活性，使攝入體內的淀粉不能水解，阻斷能量的主要來源，從而可以防御昆蟲的侵害[19, 21]。研究發現[20]，α-淀粉酶抑制劑具有較好的酸堿耐受性，蛋白性質結構在pH 4～11范圍內穩定，在70℃作用30 min后活性基本沒有變化，80℃作用10 min活性僅降低10%左右。據此分析，在黃酒煎酒的過程中，其熱穩定性好，只有少部分的α-淀粉酶抑制劑失活變性凝固析出，大部分還存在于酒液中，經過長時間的貯存，外界環境發生變化，導致其逐漸析出形成混濁。

病程相關蛋白是植物在病理環境下誘導產生的一類水溶性蛋白質總稱，主要功能為參與植物的抗病反應，降解病原物毒素，抑制病毒外殼蛋白與植物分子結合，組成植物的防衛體系[22-24]。PRs根據氨基酸序列相似度可分為PR-1～14共14個家族，其中幾丁質酶II屬于PR-3家族，能夠降解病原菌的細胞壁，提高植物的抗病能力。研究發現，PRs是一類相對分子質量為10～40 kDa的單體蛋白質，穩定性較強，大部分的PRs能夠耐受低pH、重金屬、蛋白酶和高溫[25]。據此推測，在黃酒的釀造過程中，由于PRs穩定性較好，一直存在于酒液中，經過煎酒和過濾過程，不能將其去除，最終存在于成品酒中，成為黃酒的蛋白質混濁的一部分。

類燕麥蛋白是小麥中的儲藏蛋白，其主要存在于小麥胚乳中，屬于低分子量谷蛋白，因與大麥中的燕麥蛋白序列相似而得名[26]，分為A亞型和B亞型兩種蛋白質。A亞型蛋白質所含的168個氨基酸中谷氨酸有36個，占氨基酸總量的21%，B亞型蛋白質所含的284個氨基酸中谷氨酸有80個，占氨基酸總量的28%，這與混濁蛋白氨基酸分析中谷氨酸含量占有較高比例相符合。另外，類燕麥蛋白含有高冗余的半胱氨酸殘基，分子內和分子間存在的二硫鍵可以形成高分子聚合體，對混濁形成有重要影響。

2.3黃酒混濁蛋白質的氨基酸分析

瓶裝黃酒混濁和上清中的蛋白質的氨基酸分析結果見表2。酒體蛋白非游離氨基酸的定義為總氨基酸減去游離氨基酸[28]。疏水值表示的是氨基酸的疏水性，值越大表示疏水性越強。

表2　黃酒混濁蛋白和酒體蛋白中的氨基酸分析結果

在黃酒混濁蛋白中，谷氨酸含量最高，占總氨基酸含量的20.48%，其次為脯氨酸和天冬氨酸，分別占10.12%和8.54%。在酒體蛋白氨基酸中，含量最高的也為谷氨酸，占總氨基酸含量的31.98%，其次為天冬氨酸和絲氨酸，分別占8.67%和7.53%。谷氨酸和天冬氨酸的疏水值等于零，屬于親水性的氨基酸。絲氨酸疏水值為-0.3，是親水性最強的氨基酸，在混濁蛋白中含量為4.73%，酒體蛋白中絲氨酸的含量為混濁蛋白的1.59倍。脯氨酸的疏水值為2.6，是氨基酸中疏水值較大的，在混濁蛋白中所占的比例是酒體蛋白中所占比例的1.38倍。疏水性的氨基酸在混濁蛋白中的含量為60.19%，在酒體蛋白中的含量為45.65%，前者為后者的1.32倍。酒體蛋白氨基酸平均疏水值為0.79，混濁蛋白質氨基酸平均疏水值為0.92，比酒體蛋白氨基酸平均疏水值高16.46%。表明混濁蛋白具有更強的疏水性。

2.4黃酒混濁蛋白質二級結構分析

蛋白質的二級結構是指多肽鏈的空間結構，不考慮側鏈的構象及整個肽鏈的空間排列，常見的二級結構有α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲等[14]。傅里葉紅外光譜(FTIR)是一種振動光譜，是一種研究蛋白質構象與功能關系的有效途徑，目前廣泛應用于研究蛋白質二級結構。

a-全波段傅里葉紅外光譜圖；b-酰胺I帶；c-混濁酰胺I帶；d-上清的酰胺I帶圖2　傅里葉紅外光譜圖及酰胺I帶擬合曲線Fig.2　The FTIR spectra and the fitted curve

由圖2(a)可以看出，在波段4 000～3 200 /cm，混濁蛋白質的吸光度明顯大于上清蛋白質，而在酰胺I帶(1 700～1 600 /cm)處，上清蛋白質的吸光度大于混濁蛋白質(圖2 b)，相對于混濁來說，上清蛋白質的吸光度偏向于低波段，這說明在混濁和上清中的蛋白質結構有差異。截取光譜圖中酰胺I帶的吸光度數據，利用PeakFit 4.12 software (美國Systat軟件公司)軟件進行譜圖擬合，并根據不同的峰指認相應的二級結構，根據峰面積大小計算各二級結構的相對百分含量。

由圖2c和d可知，黃酒混濁蛋白質和上清中蛋白質的擬合圖存在顯著性差異，混濁蛋白質有7個明顯的峰，而上清中只存在5個，每個峰所對應的二級結構如表3所示。表4為混濁蛋白質和上清蛋白質中各二級結構的相對百分含量。

表3　傅里葉紅外光譜擬合圖譜分析(%)

表4　黃酒混濁蛋白質和上清蛋白質二級結構含量(%)

由表4可知，混濁蛋白與上清蛋白的二級結構組成有顯著的差異，其中最明顯的是上清蛋白中不含有α-螺旋結構，而在混濁蛋白中α-螺旋的含量為15.91%，而β-折疊、無規則卷曲和β-轉角在上清蛋白中的含量分別比混濁蛋白高出26.9%、25.3%和2.4%。研究發現，蛋白質二級結構與表面疏水性相關，并且其水溶性與α-螺旋含量負相關，與β-折疊和無規則卷曲正相關，而與其β-轉角含量無相關性[11, 29-30]。高α-螺旋含量、低β-折疊和無規則卷曲含量是黃酒混濁蛋白質的主要結構特征。黃酒生產中，為了保證瓶裝黃酒的生物穩定性，一般采用80～85 ℃、40 min的條件進行殺菌[31]。可能高溫滅菌使蛋白質的高級結構包括二級結構破壞，從而導致疏水性增強，水溶性降低，最終形成混濁。

3結論

黃酒混濁蛋白主要分布在13～16 kDa和28～55.4 kDa之間。質譜鑒定結果表明，混濁蛋白中有6種來源于小麥的蛋白質，分別為類燕麥蛋白b1、類燕麥蛋白、二聚-α淀粉酶抑制劑、病程相關蛋白、病程相關蛋白-4、幾丁質酶II，來源于水稻的蛋白質主要是類燕麥蛋白和β-淀粉酶。

黃酒混濁蛋白中谷氨酸含量最高，其次為脯氨酸和天冬氨酸；混濁蛋白質氨基酸平均疏水值為0.92，比黃酒上清中蛋白質氨基酸平均疏水值高16.46%。通過FTIR分析，α-螺旋結構在混濁蛋白質中的含量為15.91%，而相對應的上清蛋白質中不含α-螺旋，并且混濁蛋白中β-折疊、無規則卷曲結構含量顯著低于其上清中相應指標的含量。因此，黃酒混濁蛋白的氨基酸組成的高疏水性和低水溶性是形成黃酒混濁的蛋白質的主要特征。

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Isolation, identification of haze proteins from Chinese rice wine and analysis of its amino acid composition and secondary structure

SUN Jun-yong1,2,3,FAN Shi-ying1,2,3,XIE Guang-fa3,4,LU Jian1,2,3,5

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)2(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)3(School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)4(National Engineering Research Center for Chinese Rice Wine,China Shaoxing Rice Wine Group Co.,Ltd,Shaoxing 312000,China)5(Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian,Suqian 223800,China)

ABSTRACTThe haze proteins were isolated from Chinese rice wine, and separated by two-dimensional electrophoresis (2-DE), then identified with matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight/time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS). The results showed that, the main components of haze proteins were proteins originated from wheat including avenin-like protein b1, avenin-like protein, dimer α-amylase inhibitor, pathogenesis-related proteins, pathogenesis-related protein - 4, and Class II chitinase, and proteins originated from rice including avenin-like protein and β-amylase. The amino acid composition and secondary structure of proteins in haze and supernatant were analyzed by high-performance liquid chromatography and fourier transform infrared spectrometer, respectively. It was found that haze proteins contained a large amount of glutamic acid, which accounted for 20.48% of total amino acids. Furthermore, the content of hydrophobic amino acids in the haze proteins was 24.2% higher than that in the supernatant. Higher content of α-helix with lower content of β-sheet and random coil was the major structural feature of the haze protein in Chinese rice wine.

Key wordsChinese rice wine; haze protein; MALDI-TOF/TOF MS; amino acid composition; secondary structure

收稿日期：2015-09-23，改回日期：2015-10-29

基金項目：973項目(2012CB720802)；973項目(2013CB733602)；紹興市科技計劃項目(申請編號2015018003)；國家自然科學基金重點項目(31130043)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目；高等學校學科創新引智計劃(111計劃)資助項目(111-2-06)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201602001

第一作者：博士研究生，講師(陸健教授為通訊作者,E-mail:jlu@jiangnan.edu.cn)。