核素锝[99mTc]對維甲酸誘導骨髓間充質干細胞的干預研究

李　瑋

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核素锝[99mTc]對維甲酸誘導骨髓間充質干細胞的干預研究

李瑋

摘要：目的研究核素锝[99mTc]對大鼠骨髓間充質干細胞誘導分化為神經元樣細胞的影響。方法采用密度梯度離心法結合貼壁培養法分離、純化大鼠骨髓間充質干細胞，以30 μmol·L-1維甲酸誘導其向神經元樣細胞分化，并測定核素锝[99mTc]干預骨髓間充質干細胞分化后的生物學影響。結果活度為740、1 110 MBq·mL-1锝[99mTc]干預骨髓間充質干細胞6 h后，細胞存活率分別為(96.03±2.21)%、(94.47±2.12)%，锝[99mTc]干預的骨髓間充質干細胞在維甲酸誘導下可表達神經元的特異性標記物Nestin和NSE。結論常規劑量下锝[99mTc]不影響骨髓間充質干細胞的細胞活力和分化。

關鍵詞：99mTc；骨髓間充質干細胞；神經前體細胞；神經元

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)的主要功能是參與構成造血干細胞生存和分化的微環境。近年發現它還具有向多種細胞系轉化的潛能[1]，可以誘導分化為神經樣細胞[2]、心肌樣細胞[3]及多種結締組織細胞(纖維、骨、軟骨、肌腱、肌肉、脂肪細胞等)[4]，并且自體獲取的骨髓間充質干細胞回輸后不會發生免疫排斥反應，體外基因轉染率高，因此骨髓間充質干細胞已成為組織工程、細胞治療、基因治療等方面的研究熱點[5]。但骨髓中骨髓間充質干細胞的含量非常少，大約每10萬個單個核細胞中只含有1個骨髓間充質干細胞[6]。因此，需在體外分離純化、培養擴增后，才能滿足臨床服務要求。

核素锝[99mTc]具有適宜的半衰期，具有極佳的射線成像品質，被廣泛應用于臨床核醫學顯像[7]，通過其所標記的亞甲基二膦酸鹽(methylene diphosphonate,MDP)與骨骼吸附應用于全身骨成像。但锝[99mTc]對其內骨髓間充質干細胞的影響目前還缺乏了解。本研究探討其對大鼠骨髓間充質干細胞的細胞活性、分化等生物學特性的影響，現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑6～8周齡的SD大鼠(雌雄不限)，體質量120 g左右，由河南省實驗動物中心提供。高糖DMEM/F12(美國Gibco公司)，全反式維甲酸、胰蛋白酶為Sigma公司產品，多聚賴氨酸、GFPA、NSE、Nestin免疫組化試劑盒(streptavidin-perosidase，SP)為北京中山生物技術有限公司產品，臺盼蘭為Chroma公司產品。

1.2實驗方法

1.2.1MSCs的分離純化取SD大鼠，引頸處死，75%乙醇浸泡5～10 min，無菌條件下將大鼠雙下肢剪下，轉移置于超凈工作臺上，分離股骨和脛骨。剪去股骨脛骨的兩端,充分暴露骨髓腔，注射器吸取5 mL10%胎牛血清的DMEM/F12培養基沖洗骨髓腔，取沖洗液，梯度密度離心3次，棄上清，用培養基重懸。1×105·mL-1接種細胞于培養瓶中，37 ℃、pH 7.2條件下培養于5% CO2培養箱。48 h可見細胞黏附貼壁，每周換液兩次，待細胞貼壁率大于90%時，0.5 mL復合消化酶消化，于鏡下密切觀察細胞形態。按1∶2傳代，重復上述操作，反復傳代為P2～P6。

1.2.2誘導分化和免疫組化染色取P4～6代細胞，以(4～5)×106·mL-1密度接種于24孔板，待細胞80%融合，用含30 μmol·L-1維甲酸、20 μg·L-1bFGF、10%FBS的DMEM/F12培養基誘導骨髓間充質干細胞為實驗組；對照組不加誘導劑。對骨髓間充質干細胞誘導前、誘導后8 d、13 d的神經巢蛋白(Nestin)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫細胞化學染色鑒定。

1.2.3锝[99mTc]對MSCs的誘導①锝[99mTc]干預MSCs細胞活力的測定：選取P4～6代骨髓間充質干細胞，無锝[99mTc]培養基為對照組，實驗組放入含锝[99mTc]配制培養基，按活度分為740、1 110、1 480、2 960 MBq·mL-14組，細胞密度(4～5)×106·mL-1。細胞培養12 h均更換為正常培養基，8 d及13 d時分別進行MTT法檢測細胞活力。每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，繼續孵育4 h后棄上清，加入100 μL DMSO終止反應。微震蕩，酶標儀波長490 nm處測得吸光度值(A)。空白對照組細胞存活率記為100%，實驗組細胞存活率(%)=(實驗組A值/空白對照組A值)×100%。②锝[99mTc]干預MSCs誘導分化的免疫組化染色：锝[99mTc]干預骨髓間充質干細胞時，得到MTT法證實細胞活力無影響的放射性比活度(740 MBq·mL-1)。以此對原代培養骨髓間充質干細胞進行干預，并在30 μmol·L-1維甲酸誘導前、誘導后8 d、13 d時，對骨髓間充質干細胞Nestin、NSE、GFAP免疫細胞化學染色鑒定，計算Nestin、NSE、GFAP染色陽性的細胞數比例。

2結果

2.1MSCs的培養原代培養72 h，貼壁細胞分裂增殖，細胞團細胞不斷分裂增殖，新生的細胞圓形，位于中心，周圍的細胞逐漸變為梭形。5 d后可見集落形成，1周后集落增多，互相融合，細胞逐漸變成梭形。多次傳代的MSCs達融合生長時，有更均勻有序的成纖維細胞樣分布，見圖1A。

2.2神經元樣細胞的誘導分化和免疫組化全反式維甲酸誘導4 d后，大部分細胞發生形態改變：較多細胞形態呈神經元樣改變，可見明顯神經元樣的細胞突起，相鄰細胞間相互聯結成網狀；7 d后大部分細胞呈神經元樣形態。對照組形態未發生明顯改變。誘導前、誘導8 d和13 d后的細胞進行NSE、Nestin、GAFP免疫細胞化學鑒定，DAB染色顯示胞質呈棕黃色為陽性表達細胞。發現神經元樣細胞特異性標記物Nestin和NSE染色呈陽性(見圖1B、C)，膠質細胞特異性標志GAFP為陰性，對照組染色均為陰性。

2.3锝[99mTc]干預MSCs細胞活力的測定與對照組相比較，锝[99mTc]濃度為740、1 110 MBq·mL-1組的細胞活力在各時間點均無明顯變化(P>0.05)；當锝[99mTc]濃度升高至1 480、2 960 MBq·mL-1時，兩組細胞活力明顯降低(均P<0.05)。見表1。

表1　不同濃度锝[99mTc]干預MSCs存活率　%

2.4锝[99mTc]干預MSCs分化的免疫組化740 MBq·mL-锝[99mTc]干預維甲酸誘導MSCs定向分化為神經元的能力，誘導前、誘導8 d和13 d后的NSE、Nestin、GAFP免疫細胞化學鑒定，DAB染色顯示胞質呈棕黃色為陽性表達細胞，發現神經元樣細胞的Nestin和NSE染色呈陽性(見圖1D、E)，GAFP為陰性。NSE表達呈逐漸上調，Nestin表達下降，對照組染色均為陰性(見表2)。

A：骨髓間充質干細胞呈成纖維細胞樣改變(×400)；B：骨髓間充質干細胞維甲酸誘導后Nestin陽性(SP，×400)；C：骨髓間充質干細胞維甲酸誘導后NSE陽性(SP，×400)；D：锝[99mTc]對骨髓間充質干細胞在維甲酸誘導后NSE染色(SP，×200)；E：锝[99mTc]對骨髓間充質干細胞在維甲酸誘導后Nestin染色(SP，×200)。圖1　锝[99mTc]對MSCS誘導的影響

%

3討論

骨髓MSCs在骨髓中的含量極少，大約10～100 MSCs/1×106BMCs左右[8]。目前對于骨髓中MSCs的分離比較常用的方法是密度梯度離心法[9]、貼壁細胞分離法、流式細胞儀和免疫磁珠分離法。作為組織工程的種子細胞，細胞的純度越高越好。密度梯度離心法操作較貼細胞分離法稍復雜，但細胞純度較后者高，更符合組織工程研究的要求。作者通過密度梯度離心法和貼壁細胞分離法分離得到大鼠骨髓間充質干細胞。將骨髓間充質干細胞經幾次傳代后，細胞變為形態更均一、排列更有序的成纖維細胞樣，通過此方法培養的MSCs在第一代時純度達90%，第二代超過95%。

[99mTc]是核素顯像中目前臨床應用最廣泛的顯像核素，70%～80%用于標記亞甲基二膦酸鹽為全身骨顯像。但其對骨髓中富集的干細胞特別是骨髓間充質干細胞的輻射能造成什么樣的后果，目前還不清楚，國內也缺乏相關的研究。本實驗應用锝[99mTc]對骨髓間充質干細胞存活和分化的影響做了研究，實驗中未發現正常檢查劑量(740～1 110 MBq·mL-1)對骨髓間充質干細胞有明顯影響。在放射性活度>1 110 MBq·mL-1時，可引起骨髓間充質干細胞的活性降低。在隨后的試驗中，作者用安全劑量(740 MBq·mL-1)的锝[99mTc]干預維甲酸誘導的MSCs向神經元樣細胞分化，8 d、13 d后發現細胞可以定向分化為神經元樣細胞，可表達神經前體細胞和神經元的特異性標記物Nestin和NSE，但分化能力總體上有所降低。

實驗證實，被锝[99mTc]干預的骨髓間充質干細胞仍具有正常生長及多向分化的能力，其毒性和劑量大小的關系不明顯。這項研究為臨床上指導核醫學常規工作以確保受檢者的安全性及核醫學醫務工作者和核醫學工作相關人員的個人防護管理等提供了基礎研究支持。

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作者單位：河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽 471003

Intervention Study of Retinoic Acid Induced Bone Mesenchymal Stem Cell Differentiated into Neuron with Nuclide Technetium[99mTc]

LI Wei

(First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

Abstract:ObjectiveTo study the impact of [99mTc] to bone mesenchymal stem cells (MSCs) induced by retinoic acid to differentiate into neuron-like cell.MethodsMSCs were isolated and purified by density gradient centrifugation and adherent culture, and then induced into neuron-like cell by 30 μmol·L-1retinoic acid. Biologcial effects of neuron-like cell were determined after [99mTc] interfered in the differentiation of MSCs.ResultsAfter the interference of 740、1 110 MBq·mL-1[99mTc] for 6 hours, cell survival rate was(96.03±2.21)% and (94.47±2.12)%respectively,and Nestin and NSE were expressed in the progress of 740 MBq·mL-1[99mTc] interfering in the differentiation of MSCs. ConclusionThe cell viability and differentiation of MSCs were not affected by the conventional dose of [99mTc] in vitro.

Key words:99mTc；bone mesenchymal stem cell；nerve precursor cell；neuron

文章編號：1672-688X(2016)02-0084-03

DOI：10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.02.002

中圖分類號：R445.5;R818.03

文獻標志碼：A

收稿日期：2016-02-22

作者簡介：李瑋(1974-)，男，河南洛陽人，醫師，從事核醫學診斷治療工作。