CASP1在非小細胞肺癌組織中的表達與生物學意義*

吳敬，林佳，張艷艷，裴娜，張雪梅

（華北理工大學生命科學學院，河北唐山063000）

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CASP1在非小細胞肺癌組織中的表達與生物學意義*

吳敬，林佳，張艷艷，裴娜，張雪梅

（華北理工大學生命科學學院，河北唐山063000）

摘要：目的探討含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase-1（CASP1）表達在非小細胞肺癌（NSCLC）發生、發展中的作用。方法收集華北理工大學附屬醫院2010～2014年確診為NSCLC患者的肺癌及癌旁組織25對。采用免疫組織化學染色方法，比較CASP1基因在肺癌和癌旁組織以及不同病理類型及分化程度肺癌組織中的表達差異。使用正常和腫瘤組織表達數據庫（GENT）提供的數據，分析CASP1在肺癌組織及正常組織中的表達差異。結果免疫組織化學結果顯示，CASP1在肺癌組織中的表達量（0.021±0.004）低于相應的癌旁組織（0.083±0.008），差異有統計學意義（t=-8.554，P=0.000）。進一步對GENT數據庫進行分析，發現在U133plus2提供的數據中，CASP1在肺正常組織中的表達量為（1137±42.17），高于其在肺腫瘤組織中的表達量（844± 19.35），差異有統計學意義（Z=-7.037，P=0.000）。同樣的結果出現在U113A提供的數據中，CASP1在肺正常組織的表達（467±11.19）高于其在肺腫瘤組織（423±8.44）中的表達，差異有統計學意義（Z=-2.898，P=0.004）。不同分化程度肺癌組織的免疫組織化學結果顯示，CASP1的表達水平在高分化（0.027±0.006）、中分化（0.017±0.003）、低分化（0.007±0.002）肺癌組織中的差異有統計學意義（F=6.653，P=0.006）。組間比較顯示，CASP1在高分化組織中的表達高于其在低分化肺癌組織中的表達，差異有統計學意義（P=0.001），但與中分化組織中的表達比較無統計學意義（P=0.056）。筆者未發現CASP1在肺腺癌（0.019±0.003）和鱗癌（0.012± 0.004）中表達差異有統計學意義（t=1.382，P=0.180）。結論CASP1在非小細胞肺癌組織中表達下調，表明其在NSCLC的發生、發展過程中可能發揮重要作用。

關鍵詞：Caspase-1；非小細胞肺癌；免疫組織化學；細胞凋亡

肺癌是嚴重影響人類生存質量的重大疾病之一。在全球范圍內，肺癌的發病率呈逐年上升趨勢，位于全部腫瘤死因的首位［1］。肺癌分非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩種。其中NSCLC約占全部肺癌發病的85%，而且70%～80%的患者發現時已處于中晚期，5年生存率極低。

Caspase（cysteinyl aspartate-specific proteases，CASP）是一組半胱氨酸天冬氨酸特異的蛋白水解酶。Caspase-1（cysteinyl aspartate-specific proteases-1，CASP1）作為最早發現的CASP家族成員之一，不僅參與細胞因子介導的炎癥反應，還與細胞凋亡過程有著密不可分的關系。研究發現，CASP1與多種疾病有關，例如：CASP1作為炎癥趨化因子在2型糖尿病發生過程中起著重要作用，可能成為治療2型糖尿病的作用靶點［2］；CASP1在多種腫瘤細胞中（如結腸癌、前列腺癌和肝癌）表達降低［3-5］，與腫瘤的發生、發展具有相關性。本研究擬通過比較肺癌與癌旁組織中CASP1的表達差異，探討CASP1在肺癌發病過程中的作用。

1　資料與方法

1.1標本收集

研究標本選取自華北理工大學附屬醫院2010～2014年期間病理存檔的石蠟標本，非小細胞肺癌組織標本和距腫瘤邊緣≥5 cm的癌旁組織各25例。非小細胞肺癌組中，男性13例，女性12例，年齡37～70歲，平均年齡57.1歲。經病理學診斷，9例鱗癌和16例腺癌。低分化7例，中分化10例，高分化8例。所有患者術前均未接受放療或化療。

1.2主要試劑

兔抗人CASP1多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，辣根過氧化酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G和免疫組織化學二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑購自北京中杉金橋生物技術公司。

1.3實驗方法

石蠟標本制成4μm厚的切片，免疫組織化學程序按照DAB顯色試劑盒說明書進行。每批實驗均設陰性對照，以磷酸緩沖鹽溶液代替一抗。組織病理切片經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，滴加3%過氧化氫H2O2進行高壓抗原修復；加入CASP1一抗（1∶80稀釋），4℃過夜孵育；37℃復溫后，加二抗37℃孵育1 h后，DAB顯色。經蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片后，使用Olympus BX53型顯微鏡進行圖像采集。

1.4結果判定

于每張切片隨機選取3個高倍視野（×400），用Image-Pro Plus 7.0分析軟件計算每個標本的平均積分光密度（累積積分光密度/面積），平均光密度值表示免疫組織化學強度，反映CASP1在組織中的表達水平。

1.5統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據分析，使用正常和腫瘤組織基因表達數據庫（gene expression database of normal and tumor tissues，GENT），分析Affymetrix U133A和U133plus2兩個平臺提供的CASP1表達數據［6］。計量資料用均數±標準（±s）表示，使用配對t檢驗比較CASP1在肺癌組織與癌旁組織中的表達差異；使用成組設計t檢驗進行兩組樣本之間的分析；使用方差分析進行多組樣本間的統計分析，組間比較用LSD-t檢驗。GENT表達數據分析采用兩獨立樣本秩和檢驗（Mann-Whitney U檢驗），P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1CASP1在肺癌組織和癌旁組織中的表達

免疫組織化學結果顯示，CASP1表達于細胞質中，呈棕黃色和棕褐色的顆粒樣物質，見圖1。CASP1在肺癌組織中呈弱陽性表達，其相對表達量為（0.021±0.004）。CASP1在肺癌旁組織中的表達量為（0.083±0.008），高于其在肺癌組織中的表達，差異具有統計學意義（t=-8.554，P=0.000）。

筆者隨后對GENT數據庫進行分析，發現在U133plus2提供的數據中，CASP1在肺正常組織中的表達量為（1 137±42.17），高于其在肺腫瘤組織中的表達量（844±19.35），差異有統計學意義（Z= -7.037，P=0.000）。同樣的結果出現在U113A提供的數據中，CASP1在肺正常組織的表達量（467± 11.19），高于其在肺腫瘤組織（423±8.44）中的表達，差異有統計學意義（Z=-2.898，P=0.004）。

2.2CASP1表達水平與臨床病理特征之間的關系

通過對不同分化程度肺癌組織的免疫組織化學結果進行比較，發現CASP1的表達水平在高分化（0.027±0.006）、中分化（0.017±0.003）、低分化（0.007±0.002）肺癌組織中的比較，差異有統計學意義（F=6.653，P=0.006）。組間比較顯示，CASP1在高分化組織中的表達高于其在低分化肺癌組織中的表達，差異有統計學意義（P=0.001），但與中分化組織中的表達，差異無統計學意義（P=0.056），見圖2。對不同病理類型肺癌組織中的CASP1表達水平進行分析，筆者發現在肺腺癌和鱗癌組織中CASP1的表達水平分別為（0.019±0.003）和（0.012±0.004），差異無統計學意義（t=1.382，P=0.180）。

3　討論

圖1　CASP1在NSCLC患者肺組織中的表達，陽性表達定位于胞漿（×400）

圖2　CASP1在不同病理分級NSCLC組織中的表達（×400）

CASP1定位于11q22，屬于炎癥型半胱氨酸蛋白水解酶家族成員，經活化后可激活IL-1β和IL-18等一系列炎癥因子，在炎癥反應中起核心調控作用［7-9］。此外，CASP1還參與細胞凋亡過程。在神經元細胞中，CASP1通過激活Caspase-6而引發細胞凋亡［10］。動物實驗表明，CASP1在成纖維細胞Rat-1中的過表達可導致細胞發生程序性死亡，而且該過程可被CASP1抑制劑所逆轉［11］。在CASP1敲除的嗜中性粒細胞也出現自發性細胞凋亡延遲的現象［12］。CASP1參與的炎癥反應與細胞凋亡能有效提高機體抵抗外源性和內源性破壞的能力，達到保護宿主的目的［13］。

筆者研究發現，CASP1在非小細胞肺癌組織中表達降低可能和CASP1在細胞炎癥反應和細胞凋亡中的重要作用有關。與筆者研究結果類似，一項卵巢癌的研究發現，CASP1在癌細胞中表達下降，而且過表達CASP1可引起癌細胞凋亡［14］。CASP1表達水平的下降也見于結腸癌和淋巴瘤細胞中［5，15］。此外，筆者還發現，CASP1在肺癌不同分化程度組織中表達量有顯著差異。高分化肺癌組織中CASP1表達量顯著高于低分化程度肺癌，提示CASP1下調與肺癌的惡化程度有關。

通常情況下CASP1以無活性的酶原存在于細胞中。CASP1的活性復合物叫做“炎癥小體”，由NLRP1、Caspase-5相互作用，并通過ASC分子與CASP1作用形成的高分子量蛋白復合體［16］。在某些創傷刺激或急性炎癥下，各種免疫細胞被募集到癥灶，分泌大量的細胞因子（如白細胞介素IL-1β和IL-18），構成炎癥微環境，對機體起到保護作用。但如果靶器官受到長期低強度刺激，會導致某些細胞原癌基因激活，使正常細胞開始向惡性細胞轉化［17］，增加腫瘤的發病風險［18-19］。目前認為，CASP1對腫瘤的調控作用在兩個方面［20］。一方面，CASP1介導IL-1β的釋放通過調控外周組織和腫瘤微環境中髓源性抑制細胞的發育，從而對腫瘤的發生、發展起到關鍵的調控作用［21］。另一方面，CASP1通過激活機體的獲得性免疫或誘導腫瘤細胞的凋亡而抑制腫瘤的生長。以無活性酶原形式存在于細胞中的CASP1，被大分子ASC二聚體激活［22］，進一步催化caspase-7和其他作用底物的蛋白水解活性［23］，引發細胞凋亡［24］。在腸炎相關的結腸癌模型中，激活的CASP1介導IL-18的釋放，有效保護上皮細胞的完整，可以防止腸炎和結腸癌的發生［25-26］。腫瘤細胞釋放危險信號，激活NLRP3炎癥小體和釋放IL-1β，誘發IL-1β依賴性的獲得性免疫，抑制腫瘤的生長［27］。這些表明CASP1發揮著重要的抗腫瘤作用。

正常情況下機體內的細胞損傷-修復和增殖-凋亡處于動態的平衡狀態，當平衡一旦被破壞就可能導致機體正常組織發生損傷，從而引起腫瘤的發生。筆者的研究證實CASP1在非小細胞肺癌發生、發展中的作用，為進一步證實細胞凋亡及炎癥反應在肺癌發生中的重要作用提供了理論基礎。

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（張蕾編輯）

論著

Significance of CASP1 protein expression in non-small cell lung cancer*

Jing Wu，Jia Lin，Yan-yan Zhang，Na Pei，Xue-mei Zhang
（College of Life Science，North China University of Science and Technology，Tangshan，Hebei 063000，China）

Abstract：Objective To explore the role of caspase-1（CASP1）in the development of non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Lung tumor and adjacent normal samples from 25 NSCLC patients were collected at the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology from 2010 to 2014. CASP1 protein expression was analyzed by immunohistochemistry. Gene expression database of normal and tumor tissues（GENT）was used to analyze the difference of CASP1 expression between lung cancer and normal lung tissues. Results Immunohistochemistry analysis revealed that CASP1 protein expression in the lung tumor tissues（0.021±0.004）was lower than that in the adjacent tissues［（0.083±0.008），t = -8.554，P = 0.000］. Analysis of the CASP1 data from GENT revealed thatbook=41,ebook=46CASP1 expression in the lung cancer tissues was significantly lower than that in the normal tissues in both U133plus2（Z = -7.037，P = 0.000）and U133A platforms（Z = -2.898，P = 0.004）. The protein expression of CASP1 in the well-differentiated lung cancer（0.027±0.006）was higher than that in the poorly-differentiated lung cancer［（0.007±0.002），P =0.001］，but not significantly different from that in the moderately-differentiated lung cancer［（0.017±0.003），P = 0.056］. There was no significant difference in the CASP1 expression between the lung adenocarcinoma（0.019±0.003）and squamous cell carcinoma［（0.012±0.004），t = 1.382，P = 0.180］. Conclusions CASP1 expression is down-regulated in non-small cell lung cancer tissues，which indicates that CASP1 protein expression may contribute to the development of NSCLC.

Keywords：caspase-1；non-small cell lung cancer；immunohistochemistry；apoptosis

中圖分類號：R734.2

文獻標識碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.009

文章編號：1005-8982（2016）10-0040-05

收稿日期：2015-11-17

*基金項目：河北省高等學校創新團隊領軍人才培育計劃（No：LJRC001）

［通信作者］張雪梅，E-mail：jyxuemei@aliyun.com